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引物设计原则及相关设计软件
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引物设计原则及相关设计软件 每个人可能都设计过引物，有成功的喜悦，也有失败的教训，首先都必须明确设计引物的目的，是用于表达、测序，还是普通的P，对于研究物种进化的，还须根据基因的保守区、特异序列进行设计。引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 一 引物设计的基本原则，其具体如下： 1 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2引物长度一般在15~30碱基之间。 3引物GC含量在40%~60%之间， 4 Tm值最好接近72℃。 5引物3′端要避开密码子的第3位。 6 碱基要随机分布。 7 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低 9引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 10引物自身及引物之间不应存在互补序列。 二 选用合适的software 下面简单的介绍几个软件的使用方法： 1 ＮoeＰrimer 打开序列后就能显示序列和限制性内切酶位点，然后在分析栏可以根据你的需要设计并搜索引物。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。可以用于搜索PCR引物，测序引物或杂交探针（包括上游引物，下游引物，或者引物对）。在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，也可以在搜索时添加接头到5’端。引物搜索后，可以对得到的引物在分析栏上进行分析，有四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer），并且在下方同时显示PCR产物，由软件就能知道你所得产物的长度和大小。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。这些分析都可以很直观的在软件的下方得到，而可以不用作其他的操作，当然也可以通过其他方式进行查看。同时这些分析都总结性地显示了该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 使用该软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。 下载网址：http://www.bio-soft.net/pcr/NoePrimer.htm ２ Primer Premier （自动搜索） 打开序列，点击Primer按钮，进一步点击search按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按 ，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再按 ，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)，根据引物设计的基本法则选择合适的引物，帮助提高工作效率。 ３ Oligo 6 （引物评价） ４ Vector NTI Suit 通过上述方法设计了引物并进行了合成，还需要优化P条件，运气好，HEHE！一次搞定！ |
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