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数字PCR技术——一种高精度、超灵敏的核酸绝对定量技术
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聚合酶链式反应（pcr），即dna扩增法，是一种用于扩增特定dna片段的分子生物学技术。这种技术最早是在1983年被美国的mullis提出，并于1985年被发明。pcr技术从发明至今已有35年历史，技术发展相对成熟。 pcr技术发展至今已至第三代，经历了定性pcr技术、定量pcr技术（qpcr）与数字pcr技术（dpcr）三个阶段。不同阶段的pcr技术的特点、应用情况与行业发展情况也不尽相同。 数字pcr（digital pcr，dpcr）是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。dpcr检测过程主要包括样品的分散、pcr扩增、荧光信号采集与数据分析。试验结果通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式计算出dna模板分子的起始浓度，从而实现绝对定量。 在介绍数字pcr之前，首先和大家回顾一下荧光定量pcr技术（real time pcr, qpcr）。荧光定量pcr在操作流程上包括：a.核酸分子提取；b.rna逆转录；c.荧光定量pcr检测这三步骤。在检测原理上荧光定量pcr主要包括两种方法：a.染料法（sybrgreen或eva green）；b.taqman探针法。 数字pcr（digital pcr，dpcr） 数字pcr技术，是一种荧光定量pcr技术的升级技术。依然是利用染料法或taqman探针法进行的荧光检测，不同的是dpcr是终点检测荧光信号，qpcr是实时检测荧光信号。而数字pcr之所以是荧光定量的升级技术，主要是利用单分子扩增实现核酸的绝对定量。数字pcr将单个dna分子置于独立的反应室中，并对其进行pcr扩增，利用taqman探针法或染料法检测特定的靶序列。 数字pcr检测主要包括三步：第一，通过特定技术将pcr反应混合液分散到几万个反应单元（反应室）；第二，单分子在反应室中扩增；第三，pcr结束后检测荧光信号，最后通过泊松分布统计数数，计算出样本的拷贝数，实现核酸分子的绝对定量。与qpcr相比dpcr的绝对定量不需要利用标准曲线实现定量，而是直接可以通过单分子扩增结合泊松分布统计，既可实现绝对定量。 因此，数字pcr与荧光定量pcr不同点，主要体现在数字pcr需要进行分区后扩增，而荧光定量pcr是不需要分区扩增，而这种分区即可实现核酸分子的单分子扩增，单分子扩增既可以提高扩增效率，同时可以提高荧光检测的灵敏性和数据的可重复性。 dpcr与qpcr比较 实时荧光定量pcr可以进行相对定量，利用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量，标准品可选择纯化的质粒dna或体外合成的ssdna等，qpcr的定量是相对标准品的定量，是一种相对定量技术。 数字pcr 是基于传统pcr、实时荧光定量pcr基础上发展起来的第3代pcr技术，它不需要标准品，也不要制作标准曲线，即能实现更灵敏、更准确的绝对定量。同时，数字pcr是单分子扩增技术，能够有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增加，反应受到抑制剂的影响就越小。 数字PCR分区方法 数字pcr的主要核心点在于将pcr反应液分区至数万微反应单元，实现单分子扩增。不同厂家利用不同方法实现核酸分子的分区，目前数字pcr分区方法主要包括2种：微滴数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)和芯片数字pcr(chip digital pcr，cdpcr)。分别通过微液滴和微流体芯片实现分液，分隔开的每个微小区域都可进行单独的pcr反应。 1）ddpcr技术，利用油包水微滴生成技术。2）cdpcr利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上。 数字pcr技术应用 数字pcr具有明显的优势，已经广泛应用于核酸检测的方方面面。肿瘤液态活检，遗传生殖检测，公共卫生检测，环境微生物检测，rna表达检测，ngs文库定量，甲基化检测的等。后期将推出数字pcr具体的应用，欢迎大家持续关注。也希望大家了解数字pcr后，能够帮助大家更好地解决目前面临的困难。 |
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数字PCR如何发展才能兼备低价、快速、精准、操作简单和多靶点检测？ 发展方向1：检测速度快 目前市场化的数字PCR技术完成一轮检测时间在2-4小时不等，与现有分子检测技术相比，已满足检测速度快的需求，未来数字PCR结合等温扩增技术有极大可能实现30min以内，完成一轮检测。可以更好地应用与病原体感染领域。 发展方向2：操作灵活简单 数字PCR已经从实验室时代进入市场化时代，从操作复杂的分体机时代进入全自动一体机时代。纵观国际和国内厂家，包括伯乐、凯杰和赛默飞等国际品牌已实现数字PCR一体机市场化。国内包括思纳福、小海龟、新羿、领航已实现数字PCR一体机市场化，其中思纳福和小海龟的一体机还能同时实现自动化样本上样功能。满足分子诊断领域对操作灵活、自动化检测的需求。 发展方向3：价格便宜 目前大家普遍认为限制数字PCR技术发展的主要原因是数字PCR使用成本昂贵，单个反应耗材成本从几百元到几十元不等，昂贵的耗材成本让大家望而却步。据了解，现阶段单个反应在20元-30元是大家普遍可以接受的，未来随着数字PCR市场的全面普及，相信使用成本可以达到与荧光PCR基本相同的水平。这也是数字PCR厂家为之奋斗的目标之一。 发展方向4：检测靶点多（超多重） 数字PCR与荧光PCR一样，都属于PCR技术，具有相同的荧光检测方法（Taqman探针法和荧光染料法），两者均受限于荧光通道数的问题，单个反应只能实现个位数靶点检测，一般单个反应实现1-6个靶点。为了克服这一行业痛点问题，数字PCR领域的行业专家都在努力探索，并且取得了重要进展。包括前面提到的南京普济生物在布局特殊的引物设计+体系优化的超多重技术；上海小海龟在布局2N指数级超多重数字PCR技术。 南京普济生物的数字PCR超多重技术，通过特殊的引物设计+体系优化，极大抑制了非特异扩增。据称目前最多实现300重检测。据了解该技术目前已经三大领域均有产品布局，包括1)肿瘤伴随诊断（结直肠癌和肺癌）；2）无创产前诊断；3）肿瘤预后监控。 小海龟超多重技术基于独创的“固态油隔水”技术，利用创新的超高特异性分子诊断酶及荧光编解码技术，可实现指数级超多重检测，单个反应/芯片理论上可实现几十至上百重的靶点检测。目前布局的产品包括：1）病原体超多重检测；2）肿瘤液态活检。 个人认为，数字PCR如果解决了PCR多重检测的行业痛点问题，势必用PCR的检测成本实现NGS临床应用，对二代测序技术的小panel可能会有冲击。因此，超多重数字PCR技术的出现，全面兼备价格便宜、检测速度快、准确度高、操作简单、检测靶点多等优势，必将成为分子诊断最佳技术选择。 |
2楼2024-03-15 17:14:56