[交流] 《Advanced Materials》:蚕丝蛋白对干细胞功能调节和组织再生修复的效应和机制 已有1人参与

中国作为最早缫丝养蚕的国家，孕育的蚕丝文化源远流长。随着科技的进步及多学科的交叉融合，蚕丝的应用已不局限于传统的纺织领域，其在组织工程和再生医学领域亦展现出巨大的潜力。丝素蛋白(SF)和丝胶蛋白(SS)是蚕丝的两种主要蛋白，是一种极具吸引力的生物材料，在组织工程和再生医学中具有很大的应用潜力。然而，它们与干细胞的生化相互作用尚不清楚。为探究蚕丝材料内在生化信号，阐明其对细胞功能和组织再生的整体影响，东南大学医学院张薇/陈佳林团队首次采用多组学测序全面解析了蚕丝蛋白介导的细胞响应及分子机制，在深入的高通量分子水平上阐明干细胞-蚕丝材料之间的相互作用，为蚕丝生物材料在组织工程和干细胞治疗领域的应用提供更加全面的见解。 相关论文以“ Silk fibroin and sericin differentially potentiate the paracrine and regenerative functions of stem cells through multiomics analysis”为题，发表在国际权威学术期刊Advanced Materials（IF=32.086）上。 首先，研究团队评估了SF和SS对间充质干细胞（MSCs）的细胞行为和功能的影响。研究者使用细胞计数试剂盒8（CCK-8）测定了MSC在暴露于0.01%至1%（w/v）各种浓度的SF和SS时的增殖情况。在不同浓度SF和SS下分别培养1，3，7天，MSCs增值正常（图1C、D）。结果表明0.2%（w/v）SF和SS都显著促进了MSC的增殖，这与之前的报道一致，即SF和SS可以作为生物活性分子来支持组织工程应用中的细胞增殖。由于0.2%（w/v）SF或SS处理的MSC增殖水平较高，因此选择该特定浓度进行以下实验。活/死细胞染色结果显示无论有没有SF或SS处理，MSC在处理后的第1、3和7天均表现出高细胞活力，SF和SS对MSCs的增殖和活力有轻微的促进作用（图1E）。之后使用Alamar Blue测定方法评估SF和SS对MSC代谢（线粒体）活动的影响，并且在这三组之间未观察到显著差异（图1F）。F-肌动蛋白染色和划痕实验结果显示SF和SS可以促进MSC中F-肌动蛋白的形成（图1G），但是SF或SS并未显著提高MSCs迁移能力。最后通过进行ALP、油红O和阿尔新蓝染色评估了用/不用SF或SS处理的MSC的成骨、脂肪和软骨形成分化，但SF和SS对MSCs的分化潜能无显著影响（图1I-K）。SF和SS在促进干细胞增殖和活力方面的有限生物活性似乎不足以阐明SF和SS在丝基组织工程和再生医学中的引人注目的治疗作用，需要进一步的探讨。 之后，研究团队通过多组学解析了SF和SS介导的细胞响应，发现SF和SS分别通过Integrin/PI3K/Akt和糖酵解信号通路显著增强MSCs的旁分泌功能，这些功能涉及细胞外基质沉积、血管生成和免疫调控等多种组织再生关键过程。 蛋白组学分析结果显示在SF和对照组中，我们确定了几个与“表皮发育”、“角化”、“细胞粘附”、“皮肤发育”、“角质形成细胞分化”、“表皮发育的正调节”、“周围神经系统轴突再生”、“上皮细胞分化”和“伤口愈合”相关的关键GO术语（图2G）。同样，在SS和对照组之间，几个BP的GO术语（包括“表皮发育”、“细胞外基质组织”、“细胞粘附”、“胶原纤维组织”、“角化”、“糖酵解过程”、“调节细胞粘附”、“细胞生长调节”、“上皮细胞分化”和“伤口愈合”）与对照组相比，显著丰富（图2H）。这些结果强烈表明，MSC响应SF和SS提供的旁分泌信号具有调节皮肤修复和再生的潜力。随后，KEGG分析显示，SF组中分泌蛋白组的变化与多种细胞通路相关，包括“ECM-受体相互作用”、“PI3K/Akt信号通路”、“粘着斑”和“补体与凝血级联”（图2I）。除了这些途径外，“果糖和甘露糖代谢”、“HIF-1信号通路”和“糖酵解/糖异生”还从SS与Ctrl中MSC显著变化的旁分泌产物中得到丰富（图2J）。这些信号通路从SF或SS处理后改变的MSCs分泌蛋白组中富集，与我们的RNA-seq数据高度一致，证实了这些旁分泌信号在细胞对SF和SS的反应中的关键作用。由于RNA-seq结果显示与生长因子和胶原相关ECM相关的基因发生显著变化，我们专门研究了它们相应蛋白质的分泌（图2K）。与我们的RNA-seq数据一致，观察到这些蛋白质的表达和分泌发生显著变化，并且SF组的胶原蛋白（COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL5A2、COL6A1和COL6A3）和生长因子（胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)3、IGFBP4和IGFBP7）优于Ctrl或SS组（图2K）。 最后，研究团队发现这些由SF和SS介导的旁分泌信号对皮肤伤口愈合的多种生物过程具有调控作用。因此，研究团队分别在体内外验证了SF和SS介导的旁分泌信号可通过调节皮肤微环境中多种常驻细胞（包括成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞）的行为和功能，进而有效促进皮肤再生。 为了探究MSCs旁分泌产物的影响，收集了用/不用SF或SS处理的MSC的CM，并将其应用于成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞的培养（图3A）。为了评估来自MSCs的旁分泌信号对皮肤修复的潜力，首先研究了它们对人类真皮成纤维细胞行为的影响。CCK-8测定表明SF或SS诱导的MSCs的这些旁分泌信号在促进成纤维细胞增殖（图3B）。此外，与第1天的Ctrl CM相比，SS CM略微增加了成纤维细胞的细胞活力（图3C）。随后使用划痕试验评估了不同CM对成纤维细胞迁移的影响。代表性图像和定量分析表明，与 Ctrl CM 和 SF CM 相比，SS CM 显著促进了成纤维细胞的迁移，而 SF CM 对成纤维细胞没有明显的促迁移作用（图 3D）。总之，这些发现表明，SF 诱导的 MSCs 分泌旁分泌因子可以促进成纤维细胞增殖，而 SS 刺激的信号增强成纤维细胞的增殖、活力和迁移。 SF水凝胶和SS水凝胶在大鼠体内的实验结果表明SF和SS通过诱导MSCs的旁分泌作用，显著增加创面愈合，促进皮肤修复和再生。作者成功建立了大鼠全层皮肤缺损模型，并应用 MSC 种子水凝胶来评估 MSC 与 SF 或 SS 相互作用的旁分泌信号对体内伤口愈合的影响。总的来看， SF 和 SS 水凝胶之间的伤口愈合率没有显著差异，表明 SF 和 SS 对 MSCs 在加速伤口愈合方面的作用相当（图4A-C）。 染色结果表明所有三组都显示出完整的表皮再生以及真皮区域形成良好且完整的胶原样组织形成。然而，SF 和 SS 水凝胶中存在明显的皮肤附属物，其特征是真皮的完全重塑，但 Ctrl 水凝胶中没有（图 4D-E）。皮肤厚度的定量分析表明，与 Ctrl 水凝胶组（1.46 毫米）相比，SF（1.86 毫米）和 SS（1.88 毫米）水凝胶组的皮肤厚度显著增加，而 SF 和 SS 水凝胶之间没有显著差异组（图 4F）。此外，SF 和 SS 增强了新形成的皮肤组织的血管生成，新血管的数量和横截面积明显高于 Ctrl 水凝胶组（图4G-H），这可能归因于更高的分泌SF 和 SS 水凝胶组中 MSCs 的血管生成因子。此外，在SF和SS水凝胶中观察到的毛囊数量高于Ctrl水凝胶（图4I）。这些结果表明，SF 和 SS 水凝胶在结构和功能上都诱导了增强的皮肤修复和再生。 最后，比较SF和SS水凝胶组之间的差异。为了全面评估不同处理后的伤口微环境，对第14天大鼠再生皮肤组织样本(每组n = 3只大鼠)进行蛋白质组学分析(图5A)。聚类分析后的所有鉴定蛋白热图显示，Ctrl、SF和SS水凝胶组之间的蛋白表达存在差异(图5B)。采用Ctrl、SF、SS水凝胶组进行两两比较，鉴定DEPs (p < 0.05)，结果发现SF和Ctrl水凝胶组之间有78个蛋白差异表达，其中47个蛋白上调，31个蛋白下调(图5C)。在SS和Ctrl水凝胶组中，我们检测到79个DEPs，其中38个上调，41个下调(图5D)。此外，SF水凝胶组与SS水凝胶组比较，发现32个DEPs上调，15个DEPs下调(图5E)。在这些DEPs中，分别有39和58个DEPs是SF vs Ctrl和SS vs Ctrl特异性的，只有9个DEPs是SF vs SS特异性的(图5F)。图5G,H揭示了不同处理后创面环境更重要的变化。为了进一步了解伤口微环境中DEPs的功能，我们进行了氧化石墨烯富集分析。在SF和Ctrl组中，几个BP GO术语从DEPs上调中显著富集，包括“伤口愈合”、“胶原纤维组织”和“突触可塑性的积极调节”(图5I)。此外，与Ctrl水凝胶组相比，SF水凝胶组CC和MF的氧化石墨烯术语有几个显著上调，如“细胞外基质”、“细胞外基质结构成分”、“胶原结合”和“血小板衍生生长因子结合”(图5J)，这可能是由MSCs的旁分泌信号介导的。此外，为了克服DEPs分析的局限性，进行了基因集富集分析(GSEA)，发现SF水凝胶激活了“伤口愈合调节”、“组织重塑”和“轴突引导”，同时抑制了伤口愈合过程中的“白细胞趋化性”，导致SF水凝胶组与Ctrl水凝胶组相比，皮肤再生能力增强(图5K)。就SS与Ctrl而言，我们发现BP和MF的重要GO术语中增强了“糖酵解过程”、“糖异生”和“磷酸丙酮酸水合酶活性”(图5L)，表明SS水凝胶组创面糖酵解增强。KEGG分析和GSEA也证实了这一点(图5N)。我们还观察到一些下调的bp有助于加速伤口愈合，包括“负调控成纤维细胞增殖”、“负调控坏死细胞死亡”和“负调控凋亡过程”(图5L)。CC的重要GO术语显示“细胞外泌体”和“突触后密度”上调(图5M)，表明伤口愈合过程中旁分泌和神经信号的传递得到改善。此外，观察到HIF-1信号也从几种糖酵解相关的DEPs (SS vs Ctrl)中富集，包括PGK1, ALDOA, ENO2, ENO3, GAPDH，证实了SS水凝胶处理皮肤伤口的代谢转换为糖酵解(图5N)。SS和SF对比，SF在皮肤修复方面更加优异（图5P） 在这项研究中，我们应用多组学技术全面阐明了SF和SS与MSC的生化相互作用，并分析了BP和分子活性的变化。转录组和蛋白质组综合分析一致表明，SF和SS启动了广泛但不同的细胞反应，并增强了MSC的旁分泌功能，这些功能通过整合蛋白/PI3K/Akt和糖酵解信号通路。SF和SS刺激的MSC的这些旁分泌信号通过影响皮肤伤口微环境中多个常驻细胞的行为，有效地改善了皮肤修复和再生。与SS相比，SF在体外和体内表现出更好的免疫调节作用，表明其作为MSC载体材料的皮肤再生潜力更大。据我们所知，这是第一项通过多组学分析提供细胞与SF和SS相互作用的全面、可靠见解的研究，这将直接有助于设计用于组织工程和干细胞治疗的丝基支架。此外，我们的研究结果强调了“组学”技术在深入、高通量分子水平上评估细胞-生物材料相互作用的重要性和可行性，这可能对组织工程支架在材料选择和脚手架设计方面的未来发展产生广泛影响。 原文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202210517 1.png 2.png 3.png 4.png 5.png 6.png

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