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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 超长引物PCR
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hobers

铁虫 (初入文坛)

[交流] 超长引物PCR

老板在国外带回一个新质粒要我们做，首先要做一个超长引物的PCR过程，因为引物里要加上信号肽和his标签等，上游引物长达97个碱基，下游引物也有51个碱基，请问：

1.这样的引物要如何分析确定是否可以用于PCR？
2.PCR程序又要怎么设置？？

望高手赐教！！不胜感激！

上游引物：5-GCTGGATCCATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCTATGCGCAACTGTGGAGATGTCAGAGGCAGT-3
下游引物：5-CGTAAGCTTTTAGTGATGGTGATGGTGATGGGGCCATGCTCTGAATGGGCA-3
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1楼 2009-10-11 22:15:15
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hobers

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2009-10-11 23:17:


质粒已经有了，引物是用来扩什么的？你要在质粒的基础上自己重新构建一个质粒吗？
说说你质粒的大小，用途，还有你为什么要设计这对引物，越详细越好
大家好帮助比啊

是要重新构建一个质粒。
我们准备从T载体扩一个片段再插入到这个新质粒里，而且还要给这个片段的5端加上信号肽，所以就把信号肽序列加到上游引物的5端，光信号肽其实已经60多个碱基了，还有20几个配对序列，还有酶切位点，所以就那么长了。。。
下游引物加了6个his准备以后纯化

不知道这样说大家清楚了没
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10楼2009-10-12 11:58:52
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普通回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个引物也太长了吧！光合成出来就不便宜啊~为什么不分几次进行PCR扩增呢？
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2楼2009-10-11 22:24:13
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keilion

铜虫 (小有名气)
引物的确很长，难度较大。希望有高人指点吧！
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3楼2009-10-11 23:12:12
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 10-12 08:17
引用回帖:
Originally posted by hobers at 2009-10-11 22:15:
老板在国外带回一个新质粒要我们做，首先要做一个超长引物的PCR过程，因为引物里要加上信号肽和his标签等，上游引物长达97个碱基，下游引物也有51个碱基，请问：

1.这样的引物要如何分析确定是否可以用于PCR？ ...

质粒已经有了，引物是用来扩什么的？你要在质粒的基础上自己重新构建一个质粒吗？
说说你质粒的大小，用途，还有你为什么要设计这对引物，越详细越好
大家好帮助比啊
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小木虫之有关部门负责人
4楼2009-10-11 23:17:38
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蓝皮鼠7983

至尊木虫 (文坛精英)

飞过蓝天
太长了，没见过啊
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海到尽头天做岸，山登绝顶我为峰。
5楼2009-10-12 00:06:02
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695

木虫 (职业作家)
呵呵，是太稀奇了，期盼楼主的结果昭著啊
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6楼2009-10-12 00:13:50
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20021239

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是有点长，不过90多应该没问题，100多都有人做过。
现在有个同学做的也有90多，只是到现在还没有P出来！
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http://www.jove.com/index/main.stp
7楼2009-10-12 00:16:07
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)
为什么不分段P呢？
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开始新的学习！
8楼2009-10-12 08:42:53
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nancysea

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by keilion at 2009-10-11 23:12:
引物的确很长，难度较大。希望有高人指点吧！

如果是以质粒为模板，应该不难扩增，可以用两步法结合Touchdown的方法，
如果模板是cDNA那么还是分段扩增好
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9楼2009-10-12 10:21:13
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