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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于TA克隆的求助
汕头大学海洋科学接受调剂
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lili1130

[交流] 关于TA克隆的求助

做TA克隆时，由于PCR结果很不稳定，所以直接用PCR产物直接跟T-18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度约1.1KB，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
克隆后，用菌液PCR检测，但是检测结果扩出的条带只有300KB左右。
想问问大家，这是什么原因？
非常谢谢！

[ Last edited by amisking on 2009-10-10 at 08:40 ]
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1楼 2009-10-10 07:48:40
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lili1130

★
amisking(金币+1,VIP+0): 10-10 08:15
更正一下
克隆后，用菌液PCR检测，但是检测结果扩出的条带只有300BP左右。
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2楼2009-10-10 07:50:20
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rainbamboo8707

金虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 10-10 08:15
可能是连入了小的片段或二聚体，有时电泳看不见并不代表就没有非特异性条带。建议切胶纯化后再连T载体。
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3楼2009-10-10 08:08:11
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
lili1130(金币+1,VIP+0): 10-10 09:56
amisking(金币+2,VIP+0): 10-10 12:39
请问你菌液PCR的引物是载体序列还是目的片段的序列？300bp应该也比引物二聚体大吧
再就是你的PCR产物是切胶纯化的吗，如果不是那难免会有非目的条带，切胶纯化会好，T载体有没有进行蓝白斑筛选呢，可以初筛一下
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4楼2009-10-10 08:17:57
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anik

银虫 (正式写手)
PCR产物纯化后再TA连接，可以保证连接效率
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5楼2009-10-10 08:31:07
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yangym1123

木虫 (小有名气)
★ ★
lili1130(金币+1,VIP+0): 10-10 09:55
lili1130(金币+1,VIP+0): 10-14 20:19
建议纯化后再连接，因为PCR产物电泳后即时没有杂带，并不代表真的没有，可能看不到，还是纯化后连接效率比较高~
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6楼2009-10-10 08:35:25
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fykxy_206

木虫 (正式写手)
★ ★
lili1130(金币+1,VIP+0): 10-10 09:54
amisking(金币+1,VIP+0): 10-10 12:39
你用的是T载体的通用引物吗？如果是的话那300bp是不是载体自连了？纯化的PCR产物也不一定能连接进T载体。所以PCR产物一定要纯化。在抗性板上多挑些菌做PCR。连接PCR产物后的目的片段应该在1.3-1.4kbp左右吧？
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7楼2009-10-10 08:40:21
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
amisking(金币+1,VIP+0): 10-10 12:39
1、菌液PCR的引物是怎么样设计的？
2、目的基因PCR后回收纯化了吗？
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8楼2009-10-10 12:32:04
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loveyjc

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 10-10 22:25
1.可能是连入了小的片段或二聚体，有时电泳看不见并不代表就没有非特异性条带。建议切胶纯化后再连T载体。
2.连接时少加载体,避免载体自连.
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9楼2009-10-10 13:39:38
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nancysea

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 10-10 22:25
amisking(金币+5,VIP+0):鼓励新虫发帖交流！ 10-10 22:26
PCR会有假阳性,有时候酶切鉴定更准确,你酶切片段确定一下真的插入片段是300左右,然后在考虑改进方法,试验还要具体描述下,才能给你更好的办法
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10楼2009-10-10 16:10:01
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