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双荧光素酶报告基因的检测
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近年来，非编码RNA（Non-coding RNA）的研究成为热点，特别是microRNA的研究。当发现一个新的miRNA，并研究其是否对相关疾病具有调控作用时，就需先对它和靶基因的调控关系做一验证，而目前最常用的靶向关系的验证方法就是：双荧光素酶报告基因检测。本文就相关检测原理、萤火虫荧光素酶、海肾萤光素酶、报告基因、检测步骤、细胞裂解及Luciferase检测作简单介绍。 检测原理 由于miRNA主要是通过作用于靶基因的3'UTR区域，这样就可以将目的基因3'UTR区域构建至含有报告基因萤光素酶的载体上，通过比较miRNA mimics或miRNA inhibitor作用后报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映出miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法还可以进一步确定miRNA与靶基因3'UTR的作用位点。 萤火虫萤光素酶 萤火虫荧光素是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化荧光素(luciferin)氧化成氧化荧光素(oxyluciferin)，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤光(bioluminescence)。萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。 海肾萤光素酶 海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素(coelenterazine)发生氧化，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光(bioluminescence)。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。 生物萤光可以通过荧光酶标仪进行测定，从而对实验结果进行定量。 报告基因 报告基因（report gene）是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。 检测步骤 常规培养细胞后进行细胞转染： （1）转染前一天将细胞计数，取2mL加入6孔板中，使得孔板的细胞密度不低于5*105个； （2）对于每孔细胞，用250uL的无血清培养基稀释2μg DNA（质粒），室温孵育5min； （3）对于每孔细胞，用250uL的无血清培养基稀释5uL Lipo2000，室温孵育5min； （4） 将2和3中的液体混合，室温孵育20min； （5） 将预先分好的贴壁细胞换成无血清培养基，加入上述复合物，在37℃，5%的CO2中培养6h，再换成完全培养基，继续在37℃，5%的CO2中培养，72h检测转染水平。 细胞裂解及Luciferase检测 RLU值的计算：在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU1值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU2值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。 |
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