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695

木虫 (职业作家)

[交流] 关于表达载体的选择!

最近通过RACE找到了一个新的基因,从转录起始碱基开始后有很多个ATG,好像不能判读那个是起始密码子,如何通过实验验证呢?是否可以把从第一个 ATG开始后的序列都导入表达载体,然后看什么样的蛋白可以表达出来,不知这种策略是否正确。 如果这样的话,那种或者是那类表达载体应该使用呢?关于酶切位点选择应该怎么考虑呢?

[ Last edited by 695 on 2009-10-6 at 05:19 ]
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jinlin

至尊木虫 (著名写手)


695(金币+1,VIP+0): 10-7 00:44
pET28a,pET30a,pET47b都可以
4楼2009-10-06 20:03:03
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yangym1123

木虫 (小有名气)

★ ★ ★
695(金币+3,VIP+0): 10-6 15:24
您通过RACE获得了全长cNDA序列吗?如果是的话,可以通过DNATOOL 6.0对全长序列进行翻译,获得起始密码子的位置,也结合NCBI Blast分析起始密码子。将开放读码框连入表达载体酶切位点的选择需要考虑1.已知序列中没有的酶切位点,2.两个酶切位点最好有公用Buffer便于酶切。将序列连入表达载体再看有什么样的蛋白表达出来,这种方法是不可取的,因为你设计引物时要考虑如何正确表达出你的蛋白的。祝你好运!
2楼2009-10-06 08:54:07
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gastrodia

金虫 (正式写手)

★ ★
695(金币+2,VIP+0): 10-6 15:24
你可以看一下近缘物种的mRNA和protein各多长,然后从不同的ATG开始翻译,分别将不同的翻译结果进行NCBI blast,然后就可以判断了,尽管得到目标基因通常具有不同的ATG,但通常只有一个阅读框是完整的
3楼2009-10-06 09:29:12
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼主说的是不是这个意思:ATG GGC ATG ATG TCA ATG ATG ATG..........这些ATG都在同一个翻译读码框内,哪一个是真正的起始密码子呢?期待后来人解决
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2009-10-07 09:31:23
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