| 查看: 978 | 回复: 0 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者Future_Eve将赠送您 6 个金币 | ||
[求助]
做ChIP-seq实验部分，目的生物是丝状真菌，ChIP下来的DNA浓度很低无法用于测序，求助
|
||
|
物种：丝状真菌 目的IP抗体：H3K4me3 我自己大概的实验流程如下： 0.甘氨酸，elution buffer现配现用 1.固体平板收菌，每个重复0.4g放入-80℃冰箱保存。 2.加入1ml刚刚加过PMSF的交联buffer（0.4M蔗糖，10mM Tris-HCl，1mM EDTA,1mM PMSF，PH=8)和10ul 100x蛋白酶抑制剂，组织研磨仪研磨60HZ，230秒 3.放到三角瓶里后，补充PMSF到5ml，加入40ul 100x蛋白酶抑制剂，加甲醛至终浓度1%，15分钟 4.2.5M甘氨酸中止交联至终浓度0.15M，10分钟。 5.洗菌丝过滤后，菌丝放到吸水纸自然吸收水分5-10分钟，切碎菌丝至15-20小块后，加入到1ml的lysis buffer（50mM HEPES，1% triton x-100， 137mM NaCl，1mM EDTA，0.1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS， 1mM PMSF，1ug/ml Leupepatin，1ug/ml pepstrain A,PH（KOH）=7.5)中，枪头混匀，吸掉上清液 6.探头式超声破碎仪破碎，离心，取2ul进行BCA蛋白质浓度测定，再取200ul上清液加RNAseA，37℃45分钟。后加20ul 5M NaCl解交联2小时，再DNA提取液抽提DNA跑胶，跑胶结果主带95-600bp（探头式超声破碎仪我尽力了）。 7.取2.4mg的蛋白质作为一个ip重复，0.6mg作为igg重复，补充lysis buffer到1ml，加入10ul 100x的蛋白酶抑制剂，加入3.5ul的abcam（货号ab8580）的抗体，4℃旋转孵育12小时 8.加入40ul protein A/G beads（MCE公司），4℃孵育2小时 9.用磁力架用三种洗脱缓冲液依次洗涤磁珠。(洗脱缓冲液1是lysis buffer补充NaCl固体至终浓度0.5M，洗脱液2：0.25M LiCl，1%NP40， 1%脱氧胆酸钠，1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, PH=8),洗脱液3是TE缓冲液） 10.加入Elution buffer（1%SDS, 0.1M碳酸氢钠），65℃加热30分钟，每5分钟漩涡震荡10秒再加热 11.磁力架吸取上清到新管，加入6ul 5M NaCl，2ul 10mg/ml 蛋白酶K，65℃解交联6小时 12.DNA提取液抽提，异丙醇和0.3M乙酸钠沉淀DNA，用75%乙醇洗一次，最后25ul的dd水溶解DNA 13.qubit测定ip组DNA浓度为0.08ng/ul，igg为0.07ng/ul 确实ip下来东西了，但是浓度达不到建库要求。 什么原因导致的哇？求大神们教教我（哭哭）@biostar2009 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有147人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
30
