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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » sma1酶切
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mzqpony

金虫 (正式写手)

[交流] sma1酶切

刚开始做酶切连接，不了解，请问用sma1单酶切产生的平末端能否可以直接与pfu高保真酶PCR回收后的产物直接连接，酶切时间一般多长，T4连接需要多长时间，Sma1酶切载体后用不用去磷酸化？
谢谢
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1楼 2009-10-02 09:48:14
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
350784478(金币+2,VIP+0):感谢参与解答。 10-2 15:04
mzqpony(金币+2,VIP+0):谢谢 10-2 23:45
楼主，告诉你我得秘方吧，我做这个做过很多次了。
PFU酶的产物我是直接拿来做连接的。质粒载体先用Sma1酶切半个小时以上（不同的载体时间可以适当延长），然后再将该酶切产物、平末端片段、10*Y BUFFER、水、PEG4000、ATP、连接酶配成连接反应体系，当然还要再这里补一些Sma1酶，边连边切，效果不错。我用的载体是PGH载体，该载体连接效率高。
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5楼2009-10-02 14:07:59
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
mzqpony(金币+2,VIP+0):谢谢 10-2 10:18
amisking(金币+2,VIP+0): 10-2 10:19
单切一般建议去磷酸化
平端可以和平端直接连
Fermentas、NEB的T4按照说明书的推荐条件连接即可
如果不放心可以4度过夜
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2楼2009-10-02 10:06:57
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mzqpony

金虫 (正式写手)
单酶切连接后怎让其环化？酶切产物还用纯化吗？
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3楼2009-10-02 10:18:21
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greatwall8596

★
mzqpony(金币+1,VIP+0):谢谢 10-2 23:45
PCR产物也用你切载体的酶（Sma1）处理，这样连上去就是环形的了呀
我一般不纯化，纯化会损失
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4楼2009-10-02 12:43:37
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