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mzqpony

金虫 (正式写手)

[交流] sma1酶切

刚开始做酶切连接,不了解,请问用sma1单酶切产生的平末端能否可以直接与pfu高保真酶PCR回收后的产物直接连接,酶切时间一般多长,T4连接需要多长时间,Sma1酶切载体后用不用去磷酸化?
谢谢
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
mzqpony(金币+2,VIP+0):谢谢 10-2 10:18
amisking(金币+2,VIP+0): 10-2 10:19
单切一般建议去磷酸化
平端可以和平端直接连
Fermentas、NEB的T4按照说明书的推荐条件连接即可
如果不放心可以4度过夜
2楼2009-10-02 10:06:57
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mzqpony

金虫 (正式写手)

单酶切连接后怎让其环化?酶切产物还用纯化吗?
3楼2009-10-02 10:18:21
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greatwall8596


mzqpony(金币+1,VIP+0):谢谢 10-2 23:45
PCR产物也用你切载体的酶(Sma1)处理,这样连上去就是环形的了呀
我一般不纯化,纯化会损失
4楼2009-10-02 12:43:37
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spiderboy

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
350784478(金币+2,VIP+0):感谢参与解答。 10-2 15:04
mzqpony(金币+2,VIP+0):谢谢 10-2 23:45
楼主,告诉你我得秘方吧,我做这个做过很多次了。
PFU酶的产物我是直接拿来做连接的。质粒载体先用Sma1酶切半个小时以上(不同的载体时间可以适当延长),然后再将该酶切产物、平末端片段、10*Y BUFFER、水、PEG4000、ATP、连接酶配成连接反应体系,当然还要再这里补一些Sma1酶,边连边切,效果不错。我用的载体是PGH载体,该载体连接效率高。
5楼2009-10-02 14:07:59
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