| 查看: 3365 | 回复: 10 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
695木虫 (职业作家)
|
[交流]
扩增cDNA全长PCR，引物设计的疑难
|
||
| 各位虫友好！通过RACE我扩增得到了全长cDNA序列，后边想设计引物进行序列验证。现在遇到了反向引物设计的问题，看到一些指导说全长cDNA扩增，Tm在60-68度，长度在27-30为宜。但是我的终止子及其后的序列是这样的：TGAAGTCCAAAATTAAATTACTGTAAAATATCTTTTGTAGTGAAAAAAAATTATATATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，像这样的序列我怎么能设计出好点的特异性引物呢？请高手们不吝赐教，感激不尽！ |
回复此楼» 猜你喜欢
272分材料子求调剂
已经有46人回复
-
材料与化工300求调剂
已经有43人回复
-
290求调剂
已经有6人回复
-
求调剂，一志愿材料科学与工程985，365分，
已经有9人回复
-
山东高校教师考核超级无底线，员工过不下去啦
已经有9人回复
-
085410 273求调剂
已经有9人回复
-
297求调剂
已经有16人回复
-
291求调剂
已经有11人回复
-
计算机22408 281分，求调剂
已经有7人回复
-
316求调剂
已经有5人回复
5楼2009-10-03 19:16:23
2楼2009-10-02 17:27:11
695
木虫 (职业作家)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 4528.5
- 散金: 126
- 红花: 5
- 帖子: 3149
- 在线: 394.1小时
- 虫号: 347369
- 注册: 2007-04-16
- 专业: 植物生理与生化
3楼2009-10-02 18:54:09
★ ★ ★ ★ ★
695(金币+1,VIP+0):多谢回复！想我3UTR如何设计序列呢？难道就设计GC含量在20-30%左右的，因为这段的GC含量实在太低 10-3 17:41
695(金币+1,VIP+0): 10-3 17:43
amisking(金币+3,VIP+0): 10-3 19:19
695(金币+1,VIP+0):多谢回复！想我3UTR如何设计序列呢？难道就设计GC含量在20-30%左右的，因为这段的GC含量实在太低 10-3 17:41
695(金币+1,VIP+0): 10-3 17:43
amisking(金币+3,VIP+0): 10-3 19:19
| 做表达研究cDNA指的是ATG到TAG这一段序列，在ATG之前的5‘非翻译区和TAG之后3’非翻译区并不重要，当引物序列达到25-28bp，特异性就很高了，如果你上下游引物的Tm在60度以上（我通常都是控制在65度左右），使用高保真酶（现在高保真酶多是热启动）扩增的时候非特异性的条带几乎就没有了，至于引物二聚体的存在基本不影响你随后的克隆，因为他和主带比起来可以忽略不计。至于考虑正反引物的Tm和GC含量的均一性，有时很难控制，序列不同吗，但是上下游引物的GC含量和Tm值相差不要超过5度 |
4楼2009-10-03 16:04:01
5