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695木虫 (职业作家)
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[交流]
扩增cDNA全长PCR，引物设计的疑难
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| 各位虫友好！通过RACE我扩增得到了全长cDNA序列，后边想设计引物进行序列验证。现在遇到了反向引物设计的问题，看到一些指导说全长cDNA扩增，Tm在60-68度，长度在27-30为宜。但是我的终止子及其后的序列是这样的：TGAAGTCCAAAATTAAATTACTGTAAAATATCTTTTGTAGTGAAAAAAAATTATATATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，像这样的序列我怎么能设计出好点的特异性引物呢？请高手们不吝赐教，感激不尽！ |
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amisking(金币+5,VIP+0): 10-3 21:37
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我没有说清楚，是我的问题，上游引物是从ATG开始，你能明白吧，下游从TAG开始是指互补上CTA开始向后数，那不就是TAG向前数，两条链是反向互补，你需要扩出的cDNA，其中一正链就是ATG开始， 5‘ATG****************TAG3’（正链） 3‘TAC****************ATC5'（负链）， 基因的全长就是ATG到TAG这一段编码区，扩出来以后，你把它插到克隆载体上，转化大肠杆菌送去测序，使用载体上插入位点两端的引物进行测序，就可以得到ORF的全长，如果你是做功能鉴定，这段ORF就足够了，如果你要做调控，我们才考虑非翻译区 |
6楼2009-10-03 21:11:44
2楼2009-10-02 17:27:11
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695(金币+1,VIP+0):多谢回复！想我3UTR如何设计序列呢？难道就设计GC含量在20-30%左右的，因为这段的GC含量实在太低 10-3 17:41
695(金币+1,VIP+0): 10-3 17:43
amisking(金币+3,VIP+0): 10-3 19:19
695(金币+1,VIP+0):多谢回复！想我3UTR如何设计序列呢？难道就设计GC含量在20-30%左右的，因为这段的GC含量实在太低 10-3 17:41
695(金币+1,VIP+0): 10-3 17:43
amisking(金币+3,VIP+0): 10-3 19:19
| 做表达研究cDNA指的是ATG到TAG这一段序列，在ATG之前的5‘非翻译区和TAG之后3’非翻译区并不重要，当引物序列达到25-28bp，特异性就很高了，如果你上下游引物的Tm在60度以上（我通常都是控制在65度左右），使用高保真酶（现在高保真酶多是热启动）扩增的时候非特异性的条带几乎就没有了，至于引物二聚体的存在基本不影响你随后的克隆，因为他和主带比起来可以忽略不计。至于考虑正反引物的Tm和GC含量的均一性，有时很难控制，序列不同吗，但是上下游引物的GC含量和Tm值相差不要超过5度 |
4楼2009-10-03 16:04:01
695
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5楼2009-10-03 19:16:23
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