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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 扩增cDNA全长PCR，引物设计的疑难
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695

木虫 (职业作家)

[交流] 扩增cDNA全长PCR，引物设计的疑难

各位虫友好！通过RACE我扩增得到了全长cDNA序列，后边想设计引物进行序列验证。现在遇到了反向引物设计的问题，看到一些指导说全长cDNA扩增，Tm在60-68度，长度在27-30为宜。但是我的终止子及其后的序列是这样的：TGAAGTCCAAAATTAAATTACTGTAAAATATCTTTTGTAGTGAAAAAAAATTATATATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，像这样的序列我怎么能设计出好点的特异性引物呢？请高手们不吝赐教，感激不尽！
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1楼 2009-10-02 04:51:59
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+5,VIP+0): 10-3 21:37
我没有说清楚，是我的问题，上游引物是从ATG开始，你能明白吧，下游从TAG开始是指互补上CTA开始向后数，那不就是TAG向前数，两条链是反向互补，你需要扩出的cDNA，其中一正链就是ATG开始，
5‘ATG****************TAG3’（正链）
3‘TAC****************ATC5'（负链），
基因的全长就是ATG到TAG这一段编码区，扩出来以后，你把它插到克隆载体上，转化大肠杆菌送去测序，使用载体上插入位点两端的引物进行测序，就可以得到ORF的全长，如果你是做功能鉴定，这段ORF就足够了，如果你要做调控，我们才考虑非翻译区
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6楼2009-10-03 21:11:44
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
695(金币+1,VIP+0):谢谢回复，能否再做下解释，多谢了！为什么二聚体无所谓？还有就是引物与模板错配的话话，该怎么考虑？应该考虑正反引物的Tm和GC含量的均一性吗？ 10-2 18:57
amisking(金币+2,VIP+0): 10-3 19:19
扩增cDNA的引物通常是正向：ATG开始25-28左右的序列，反向终止子前25-28左右的序列，有二聚体也无所谓，关键是引物的Tm值要高，终止子之后的序列最好不要用
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2楼2009-10-02 17:27:11
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
695(金币+1,VIP+0):多谢回复！想我3UTR如何设计序列呢？难道就设计GC含量在20-30%左右的，因为这段的GC含量实在太低 10-3 17:41
695(金币+1,VIP+0): 10-3 17:43
amisking(金币+3,VIP+0): 10-3 19:19
做表达研究cDNA指的是ATG到TAG这一段序列，在ATG之前的5‘非翻译区和TAG之后3’非翻译区并不重要，当引物序列达到25-28bp，特异性就很高了，如果你上下游引物的Tm在60度以上（我通常都是控制在65度左右），使用高保真酶（现在高保真酶多是热启动）扩增的时候非特异性的条带几乎就没有了，至于引物二聚体的存在基本不影响你随后的克隆，因为他和主带比起来可以忽略不计。至于考虑正反引物的Tm和GC含量的均一性，有时很难控制，序列不同吗，但是上下游引物的GC含量和Tm值相差不要超过5度
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4楼2009-10-03 16:04:01
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普通回帖

695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-10-2 17:27:
扩增cDNA的引物通常是正向：ATG开始25-28左右的序列，反向终止子前25-28左右的序列，有二聚体也无所谓，关键是引物的Tm值要高，终止子之后的序列最好不要用

这次测序就是为了验证我的cDNA全长序列是否正确，后边还要做表达研究。要是引物都设计在起始子和终止子内，不是扩出来的序列还是不完整的吗？

[ Last edited by 695 on 2009-10-2 at 18:55 ]
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3楼2009-10-02 18:54:09
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
695(金币+1,VIP+0):你说的这个向前有点含糊啊，是不是在ORF区域里边，还是在UTR后边设计？为什么要在UTR往前数，这样不是扩增不出全长ORF吗？ 10-3 19:36
下游引物从tag向前数25-28bp即可，如果25-28bp的GC含量不够，可以适当延长，但最好不要在3‘UTR区域设计引物，如果一定要在3’UTR区域设计，可以来回滑动，寻找最适的GC含量
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5楼2009-10-03 19:16:23
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695

木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-10-3 21:11:
我没有说清楚，是我的问题，上游引物是从ATG开始，你能明白吧，下游从TAG开始是指互补上CTA开始向后数，那不就是TAG向前数，两条链是反向互补，你需要扩出的cDNA，其中一正链就是ATG开始，
5‘ATG************** ...

非常感谢您的不吝赐教，多谢了！
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7楼2009-10-04 06:09:48
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magy2006

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
分析的却是不错了,学习了阿
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8楼2009-10-05 10:13:27
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xinying7006

木虫 (正式写手)
学习了，感谢感谢
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9楼2009-12-03 11:56:50
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yangjunzju

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
高手过招，受教了。。。
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10楼2010-03-14 19:58:16
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