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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 测序一直错误
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&夏至

新虫 (初入文坛)

[交流] 测序一直错误 已有5人参与

最近在把一段400bp左右的片段连接到载体上，用的是无缝克隆连接的，第一次连接完去测序，六个样品，每个都出现碱基缺失或者碱基错误，还都发生在中间部位，有的在同源臂连接部分，有的在序列中间，（错误都不在测序前后100bp内），换了一家无缝克隆的试剂盒（诺唯赞的）重新做了一次，最后取PCR产物去测序，结果又在不同的关键部位有碱基错误，每一个测序样品都是。实验做PCR全程用的高保真酶，现在不知道怎么办了以前做无缝克隆从来没有出现过这样的情况啊有没有大佬给指导一下啊

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1楼 2023-05-25 20:27:27
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打工人小欢

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
400bp如果克隆有问题，还是送到公司直接合成吧，即快又节省时间，费用也不高，你测克隆的钱都够了

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12楼2023-06-08 14:53:44
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1，你可以找小伙伴顺带帮你做一遍，看结果是否一样。2，多个样品出现序列与参考序列不一致，考虑是不是序列本身就是这样的。可以把两次的测序结果进行比对，看错误匹配处碱基是否一致，如果是一样的，那表明你所用材料里的目标序列就是这样的。

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
2楼2023-05-25 22:25:58
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shuaibia6

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
其实这是个很正常的想象，只是你之前没碰到而已
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3楼2023-05-26 08:48:38
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&夏至

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2023-05-25 22:25:58
1，你可以找小伙伴顺带帮你做一遍，看结果是否一样。2，多个样品出现序列与参考序列不一致，考虑是不是序列本身就是这样的。可以把两次的测序结果进行比对，看错误匹配处碱基是否一致，如果是一样的，那表明你所用材 ...

每个错误位置都不一样呀，序列本身之前做过测序是对的，现在怀疑做PCR扩增的序列过长，酶的保真度不够
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4楼2023-05-26 11:13:05
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