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[交流]
基于多步衍生化的GC-MS法测定胸腺法新中D型氨基
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摘要: 建立多步衍生化气相色谱-质谱(GC-MS) 测定手性氨基酸的方法, 并结合氘代盐酸水解应用于胸腺法新 中 9种D型氨基酸的含量测定。以异丙醇和三氟乙酸酐为衍生化试剂, 对多步衍生化的反应条件、供试品复溶试剂 的体积、色谱及质谱条件进行优化, 建立胸腺法新中 9种氨基酸测定方法, 考察灵敏度、线性范围、精密度、准确度和 加标回收率等。结果表明, 16对D/L型氨基酸和 Gly衍生物在29min内实现基线分离; 胸腺法新中的 9种氨基酸衍 生产物在一定浓度范围内线性关系良好 (r2>0.992 3); 定量限低至 0.09～2.79 μmol ·L- 1; 精密度实验结果表明RSD< 10.90%; 对照品准确性实验的平均回收率为 76.69%～128. 18%; 样品平均加标回收率在 70.41%～125.39%之间。6 批胸腺法新原料药中D-Asp和D-Glu含量较高, 分别为 0.41%～0.49%和 0.25%～0.33%, 其他D-氨基酸含量均小于 0.25% 。本方法高效、准确、专属性好, 可同时监控胸腺法新中 9种D型氨基酸含量, 有望为合成多肽药物全面控制 杂质提供新的研究思路。 胸腺法新 (thymalfasin) 是由 10 种L- 氨基酸组成 的合成二十八肽, 其制剂注射用胸腺法新在临床上主 要用于免疫缺陷, 病毒感染以及肿瘤的治疗, 并且在缺 少新冠肺炎特效药的背景下作为免疫增强药物被广泛 使用, 因此该多肽药物的质量控制显得至关重要。除 中国药典 (ChP2015) 外, 其他各国药典均未收载胸腺 法新及其制剂。ChP2015中胸腺法新及其有关物质的 分析多采用基于杂质对照品的HPLC法[1-3] 。消旋肽为 多肽链中含一个或多个非预期手性构型的氨基酸残基 所形成的肽链[4], 由于该类杂质与主成分的结构差异 小、色谱分离困难且合成杂质对照品的成本较高, 因此 HPLC法无法对潜在的所有消旋肽进行全面控制。目 前该类杂质的最新质控思路是将合成多肽完全水解成 游离氨基酸, 通过分离及计算D/L 氨基酸的相对含量 来对消旋肽杂质进行间接控制[5] 。美国药典(USP42)[6] 就是采用 GC-MS 方法对水解后艾塞那肽中D-His 和 L-His响应值的相对比例进行测定, 以控制D-His1 消旋 肽杂质含量。该方法具有无需合成多肽杂质对照品, 且 不要求消旋肽在色谱上完全分离等优势。目前USP42 的方法仅对艾塞那肽中D-His进行控制, 但 GC-MS良 好的分辨率和灵敏度[7,8] 有望从氨基酸角度全面监控 多肽中所有氨基酸发生消旋化的可能性。因此, 本文 旨在建立基于 GC-MS 的常见氨基酸分析方法并应用 于胸腺法新的质量控制。 为了测定氨基酸需要先将多肽进行水解, 而水 解过程不可避免会引起少量手性氨基酸消旋化 。因 此, 本文采用氘代盐酸/重水溶液 (deuterium chloride/ deuterium oxide, DCl/D2O) 水解胸腺法新, 该方法可以 使在水解过程中发生外消旋的氨基酸手性碳 (“-碳) 标 记上一个氘 (分子量增加 1 Da), 进一步通过高分辨质 谱即可区分水解产生的D-氨基酸和原始的D-氨基酸。由于氨基酸为极性物质, 需要先对其进行非手性衍生 化以提高挥发性才能用 GC分析。主要的衍生化方法 有: 酯化、酰化和硅烷化等。其中, 硅烷化反应要求无 水环境, 反应条件苛刻, 且极易影响反应效率。氯甲酸 酯[9] 作为酰化试剂的一种, 具有反应快速和副产物少 等优点, 但其无法对氨基酸 (如Thr和 Ser) 侧链上的脂 肪族羟基衍生化, 因此导致这些极性较大的化合物难 以从色谱柱上洗脱下来。相比之下, 全氟酸酐不仅能使氨基酸 “ -碳上的氨基酰化, 还能衍生化氨基酸侧链的 羟基或氨基, 大大增加其挥发性。目前文献[9]报道中, 利用异丙醇 (isopropanol, IPA) 与三氟乙酸酐 (trifluo- roacetic anhydride, TFAA) 分别进行酯化和酰化的两 步衍生化方法具有较好的对映体分离度和灵敏度, 在 Chirasil-L-Val 柱上最多可成功分离 15 对D/L- 氨基酸 的N(O,S)-三氟乙酰基异丙酯衍生物, 因此是本文的主 要衍生化试剂组合候选对象。 由于合成多肽药物中含有不同氨基酸, 各氨基酸 的侧链结构不同, 其化学性质也具有较大差异, 因此针 对常见氨基酸建立 GC-MS 分析方法具有较大难度。目前该方法待改进之处在于: ① Trp、Arg和His等具有 较高分子量和极性的氨基酸可能在柱上无限期地保 留[10] ; ② Asp、Glu、Ser、Thr和Tyr等氨基酸侧链中含有 羟基, 可能影响其衍生化效率和衍生产物的稳定性[9] ; ③ 现有文献中 GC-MS定量方法未曾应用于氘代水解 的氨基酸产物, 其定量离子和方法专属性有待研究。本文采用的基于 IPA和 TFAA衍生化的氨基酸测定方 法是对文献[9, 11- 14]方法的改进 (氨基酸衍生化反应通式 如图 1所示), 通过正交设计优化多步衍生化反应中的 试剂用量、反应温度和时间等条件提高氨基酸衍生产 物的衍生化效率和稳定性; 通过增加第三步操作使氯 甲酸异丁酯 (isobutyl chloroformate, IBCF) 与 His侧链 上的咪唑环衍生化, 减弱其极性而得以分析, 最终该方 法可以在较短时间 (29 min) 内同时测定 17 种氨基酸 (除 Asn、Gln 和 Arg) 。采用氘代盐酸对胸腺法新进行 水解, 对文献[10, 15] 报道的定量离子方法进行调整和优 化。由于胸腺法新中含有的Asn会在酸水解和衍生化 过程中转化为 Asp, 因此对胸腺法新中其他 9 种氨基 酸 (Ala、Asp、Glu、Ile、Leu、Lys、Thr、Val、Ser) 进行分 析, Asn 以 Asp 结构计算 。由于胸腺法新不含 His, 因 此对氘代酸水解得到的氨基酸进行 IPA和 TFAA两步 衍生化处理, 建立胸腺法新中D- 氨基酸的定量方法, 并对方法进行了方法学验证 。采用已优化及验证的 GC-MS 方法对 6 家企业生产的胸腺法新原料药中D- 氨基酸含量进行准确测定。本实验从氨基酸层面反映 对映体纯度, 为胸腺法新的质量控制提供新的方法, 有 望为合成多肽药物全面控制消旋肽杂质提供参考。 图片 材料与方法 仪器与材料 7890A/5975C气相质谱联用仪 (美国 Agilent公司); 离心机 (美国 Eppendorf公司); MS-204S 电子天平 (瑞士Mettler Toledo公司); Milli-Q型超纯水 仪 (美国Millipore公司); 烘箱 (德国Memmert公司)。 氨基酸对照品: D-亮氨酸和D-赖氨酸对照品; D-异亮氨酸 对照品; L-半胱 氨酸对照品购自国药集团化学试剂有限公司; 其他 L- 氨基酸对照 品和 D- 氨基酸对照 品 (Merch KGaA, Darmstadt, 德国), 氨基酸批号信息见表 1; DCl (35%, 批号: MBBC4507)、D2O (批号: MKCG0822)、TFAA (批 号 : BCBZ4625)、三氟乙酸乙酯 (ethyl trifluoroacetate, TFAEt) (批号: MKCC4812) 和十二烷酸甲酯 (99.95%, 批 号 : BCBF7114V) 均购 自 Merch KGaA (Darmstadt, 德国); 盐酸 (HCl)、IBCF (批号: 80025282) 购自国药集 团化学试剂股份有限公司; 色谱纯二氯甲烷 (CH2Cl2) (Thermo Fisher Scientific, 美 国); 色谱纯 IPA (Anaqua Chemicals Supply, 美国) 。6批胸腺法新原料药含量均 为 100%, 自编号 1～6分别对应企业A(批号: 171001)、 企业B (批号: S00620171201)、企业C (批号: 1711012)、 企 业 D ( 批 号 : THSA141101-R)、企 业 E ( 批 号 : 0281711001) 和企业F (批号: C109-A-6180101)。 图片 色谱和质谱条件 CP-Chirasil-L-Val: N-丙酰基-L- 缬氨酸-叔丁基酰胺聚硅氧烷WCOT熔融石英毛细管 柱 (25 m×0.25 mm ID, 涂膜厚度 0. 12 μm, 美国Agilent 公司); 载气: 高纯氦气; 分流比 1∶50; 流速 1.0 mL ·min- 1 ; 进样量 1.0 μL; 进样口温度: 200 ℃ ; 柱温: 程序升温, 初 始温度 98 ℃ , 维持 8 min, 以 8 ℃ ·min- 1 升温至 170 ℃ , 维持 0 min, 以 10 ℃ ·min- 1 升温至 190 °C, 维持 10 min。离子源: 电子轰击源 (EI); 电子能量 70 eV; 离子源温 度: 230 ℃ ; 四极杆温度: 150 ℃ 。采集方式: 选择离子 扫描 (SIM), 定量离子见表2。 图片 数据处理 通过 GC-MS Advanced software (美国 Agilent公司) 获得各氨基酸衍生产物的提取离子流图(EIC), 并对各待测化合物的峰响应值进行记录, 采用 公式 (1) 进行定量分析。 图片 式 (1) 中AD 为样品溶液中各D- 氨基酸的峰值响 应, AL 为样品溶液中对应L-氨基酸的峰值响应, AD* 为 水解中由L-氨基酸外消旋化产生的D-氨基酸的峰值 响应。 氨基酸对照品溶液制备 精密称取各氨基酸对照 品约 10 mg于 50 mL量瓶, 加水溶解并定容至刻度, 即 得 。内标溶液: 适量称取十二烷酸甲酯, 用 CH2Cl2 配 成2 mg ·mL- 1 溶液 供试品溶液制备 氘代盐酸溶液: 精密量取 35% DCl 与 D2O 以 1∶1 (v/v) 混合即得, 随配随用 。取胸腺 法新原料药约 1 mg加入氘代盐酸溶液 350 μL溶解, 充 氮, 密封, 置 110 ℃烘箱放置20h, 放冷, 用氮气流吹干 过量试剂, 进行衍生化反应。 衍生化反应方法 取 1～2 mg供试品水解物或氨 基酸对照品, 加 DCl/IPA 溶液 (1∶5, v/v) 250 μL, 置于 110 ℃酯化反应 50min 。冷却后开盖, 用氮气流吹干 过量试剂 。加 TFAA/TFAEt 溶液 (1∶1, v/v) 250 μL 溶 解产物, 置于 130 ℃酰化反应 20min 。冷却后用氮气 流吹干过量试剂 。His 需要进行第三步衍生化, 即加 IBCF 100 μL 溶解产物, 置于 120 ℃酰化反应 20 min。冷却后用氮气流吹干过量试剂, 用适量 CH2Cl2 复溶最 终产物, 转移至进样小瓶, 进样。 衍生化条件的优化 正交设计考察DCl/IPA酯化 试剂中不同用量比例 [250 μL ( 1∶5, v/v)、250 μL ( 1∶2, v/v)、400 μL ( 1∶2, v/v)]、酯 化 反 应 温 度 (90、100、 110 ℃)、酯化反应时间 (20、30、50 min)、TFAA/TFAEt 酰化试剂用量 (80∶160、100∶200、125∶125 μL)、酸酐酰 化反应温度 (100、110、130 ℃ )、酸酐酰化反应 时 间 ( 10、20、30 min)、第三步酰化反应试剂及用量 (IBCF 50 μL、IBCF与CH2Cl2 各 50 μL、IBCF 100 μL)、IBCF酰 化反应温度 (100、110、120 ℃) 和 IBCF 酰化反应时间 ( 10、15、20 min) 对衍生化效率的影响。 供试品复溶试剂体积的优化 参照胸腺法新中各 L-氨基酸的摩尔比关系, 分别配制L-氨基酸储备液 (L- Ser、L-Glu、L-Thr、L-Ala、L-Val、L-Ile、L-Leu、L-Lys和L- Asp 浓 度 分 别 为 7. 11、14.20、7.08、7.09、7.09、2.37、 2.40、9.45 和 9.47 mmol ·L- 1) 和 D- 氨基酸储 备 液 (D- Ser、D-Glu、D-Thr、D-Ala、D-Val、D-Ile、D-Leu、D-Lys 和D-Asp 浓度分别为 1.41、2.84、1.42、1.42、1.42、0.48、 0.47、1.89和 1.90 mmol ·L- 1) 。取D-氨基酸溶液适量, 加 入到L- 氨基酸溶液中, 分别配成各D- 氨基酸浓度为0.25%、0.50%、1.00%和2.00%的混合氨基酸对照品溶 液, 每个样品平行制备 3份衍生物, 以D-氨基酸的平均 回收率为指标, 单因素考察复溶样品的溶剂 (CH2Cl2) 体积 (1、2、5、10、20、30 mL) 对各氨基酸衍生物平均回 收率的影响。 方法学考察 系统适用性 将混合氨基酸对照品溶液, 按上述 方法操作, 制备衍生产物, 加入内标溶液 50 μL, 连续重 复进样 6 次, 记录各氨基酸衍生物和内标物的响应值 比值Aaa/AIS, 并计算RSD。 线性关系和定量限 将混合氨基酸对照品的衍生 产物稀释成一系列梯度溶液以衍生物峰的响应值 (Y) 及相应的浓度 (X) 进行线性回归。以各化合物的信噪 比为 3计算检测限 (LOD), 以信噪比为 10计算定量限 (LOQ)。 精密度 取胸腺法新原料药按上述方法操作制备 供试品衍生产物, 平行6份, 其中一份连续进样6次, 按 上述方法测定, 记录各衍生物峰响应值, 按公式 (1) 计 算D-氨基酸含量及其RSD。 准确度 按“供试品复溶试剂体积的优化”操作配 成 CD/(CD+CL) 浓度比为 0.25%、0.50%、1.00%和 2.00% 的氨基酸对照品溶液, 按上述方法操作制备混合对照品 衍生产物, 按上述方法测定, 每个浓度平行3份, 计算对 照品平均回收率。 加标回收率 取胸腺法新原料药氘代盐酸水解产物 加入混合氨基酸对照品, 使各待测D-氨基酸的最终含量 为 0.50%～1.00%, 按上述方法操作制备供试品衍生产 物, 平行6份, 按上述方法测定, 计算平均加标回收率。 结果 1 衍生化条件优化 综合极差分析结果和单因变量的多因素方差分析 结果, 得到适用于 17种氨基酸衍生化反应的整体最优 因素水平分别是: 第一步酯化反应试剂为250 μL DCl/ IPA ( 1∶5, v/v)、酯化反应温度为 110 ℃、酯化反应时间 为 50 min; 第 二 步 酰 化 反 应 试 剂 为 250 μL TFAA/ TFAEt溶液 (1∶1, v/v)、酰化反应温度为 130 ℃、酰化反 应时间为 20 min; 仅针对 His 的第三步酰化反应试剂 为 100 μL IBCF溶液、酰化反应温度为 120 ℃、酰化反 应时间为20 min。 2 供试品复溶试剂体积的优化 结果表明, 各氨基酸衍生物的平均回收率随着 复溶样品的溶剂体积的变化而变化, 且每种浓度的样 品得到的测定结果RSD (n = 3) 均小于 10.42% 。其中, D-Ala、D-Ile和D-Ser在 CH2Cl2 体积为 1 mL时, 可以得 到最佳的平均回收率范围为 80.78%～128. 18%; D-Val、 D-Leu和D-Glu在CH2Cl2 体积为2 mL时可以得到最佳 的平均回收率范围为77.75%～125.48%; D-Thr在CH2Cl2 体积为 5 mL 时可以得到最佳的平均回收率范围为 81.88%～99.93%; D-Asp 在 CH2Cl2 体积为 10 mL 时可 以得到最佳的平均回收率范围为 76.69%～105.01%; D-Lys在 CH2Cl2 体积为 30 mL时可以得到最佳的平均 回收率范围为 80.65%～96.32% 。这是因为多步衍生化 的最后一步氮气吹干后, 复溶样品所用的 CH2Cl2 体积 决定了样品中L-氨基酸的进样浓度, 而数据处理的公 式 (1) 不仅与D-氨基酸含量有关, 还与L-氨基酸终浓度 有密切的联系, 因此为准确测定胸腺法新中不同D-氨 基酸含量, L-Ala、L-Ile、L-Ser、L-Val、L-Glu、L-Leu、L- Thr、L-Asp 和L-Lys 最佳的进样浓度分别为 1 011.25、 335.96、1 009. 17、507.01、1 006.97、171.2、201.3、133.96 和44.71 μmol ·L- 1。 3 方法学验证 3.1 专属性 在上述色谱和质谱条件下, 16对D/L-氨 基酸和 Gly 在 29 min 内实现基线分离 。由于 Chirasil-L-Val色谱柱的手性材料中L-缬氨酸的空间构型使与 其手性中心相连的二酰基结构和待测L-氨基酸上的羰 基形成更强的分子内氢键, 从而导致L-氨基酸衍生物 在色谱柱中的保留时间延长, 因此D-氨基酸衍生物在 相应的L-对映体之前出峰[16, 17], 见图2 。系统适应性实 验结果显示各氨基酸衍生物的相对标准偏差 RSD< 6.97%, 表明方法的系统适用性良好 。各氨基酸衍生 物的分子质量、保留时间、定量离子和定性离子信息见 表2 。由于Gln和Asn在衍生和水解反应中会完全水解 成Glu和Asp, 而Arg侧链上胍基的氮无法全部被TFAA 或 IBCF 酰化, 分子极性大且沸点高, 因此无法检测 Gln、Asn和Arg衍生产物。 图片 3.2 线性关系和定量限 结果显示, 在设计的进样浓 度范围内各化合物线性关系良好, r2 均大于 0.992 3。各氨基酸衍生物的检测限和定量限范围分别为0.05~ 1.40 μmol ·L- 1 和 0.09～2.79 μmol ·L- 1, 表明该方法灵敏 度良好。结果见表3。 图片 3.3 精密度 实验表明, 6 份供试品溶液中 9 种D-氨 基酸峰测定结果的RSD均小于 10.90%, 连续重复进样6针的结果RSD均小于10.43%, 表明方法的精密度良好。3.4 准确性和加标回收率 对照品准确性实验结果表 明, 各氨基酸得到的平均回收率为 76.69%～128. 18%, 且每种浓度的样品测得结果的 RSD (n = 3) 均小于 10.42% 。其中, Ala、Ile、Val、Leu、Thr 和 Glu 适用的D- 氨基酸浓度范围为 0.50%～2.00%; Ser 适用的D-氨基 酸浓度范围为 1.00%～2.00%; 而 Asp 和 Lys 由于定量 限较低, 因此可准确检测的D-氨基酸浓度低至 0.25%, 综上说明大多数D-氨基酸在 0.50%～2.00% 浓度内的 回收率良好。加标回收实验结果表明, 胸腺法新原料药 中9种D-氨基酸的平均加标回收率为70.41%～125.39%, RSD 在 2. 15%～10.91% 之间, 说明该方法在 0.50%~ 1.00%浓度范围内测定的准确度良好。 4 样品测定 检测 6 批不同厂家的胸腺法新原料药, D-Asp 和 D-Glu含量较高, 分别为0.41%～0.49%和0.25%～0.33%, 其他D-氨基酸响应值比值均小于0.25%, 结果见表4。 图片 讨论 本文建立了多步衍生化 GC-MS 法测定胸腺法新 中 9种D-氨基酸含量的方法, 具有如下优点: ① 衍生 化效率较高且衍生产物稳定, 极大缩短分析时间, 在 29 min内 16对D/L-氨基酸和Gly实现基线分离; ② 氨 基酸对映体测定种类增加至 17种; ③ 可用于胸腺法新 中D-氨基酸含量测定, 且重复性、精密度及回收率等 良好, 相比HPLC法, 该方法无需合成消旋肽杂质对照 品, 能快速反映胸腺法新中非预期氨基酸对映体含量。 多步衍生化反应条件优化是手性氨基酸定量分析 的关键因素 。本实验以 17 种氨基酸衍生产物与内标 的峰值响应比值为指标, 对多步衍生化反应的反应试 剂用量、反应温度和反应时间等进行正交设计实验考 察, 得到整体最优的衍生化反应条件。当氨基酸个别 因素的最佳水平不完全与预选方法组合相同时, 进一 步通过方差分析验证了在该预选方法组合条件下, 所 有显著性影响 (P<0.05) 各氨基酸衍生效率的关键因 素均处于最佳水平, 而个别氨基酸未满足最佳水平的影 响因素恰好为非关键因素 (P>0.05), 对衍生化效率影响不明显, 因此该整体最优反应条件组合适用于 17种氨 基酸衍生化。通过对色谱和质谱条件优化, 在 29 min 内实现了各氨基酸对映体的有效分离; 为了实现原始 存在和水解过程产生D-氨基酸的区分, 本实验采用了 氘代盐酸水解并基于定量离子结构式包含 “ -碳及其上 氢离子的原则调整了 17种氨基酸的定量离子; 同时对 胸腺法新供试品复溶体积进行优化, 对已优化的方法 进行线性、定量限、精密度、准确性和加标回收率等方 法学考察, 验证了定量方法准确可靠。 本方法成功应用于对胸腺法新中 9 种D 型氨基 酸的定性和定量测定, 发现各厂家产品的D型氨基酸 含量趋势一致, 其中D-Asp 和D-Glu 含量较高 。虽然 ChP2015 仅列出常见的 [D-Ser1-胸腺法新] 杂质结构, 但实验结果表明胸腺法新原料药还可能存在含其他 D-氨基酸的消旋肽杂质。该结果提示, 厂家在生产过 程中应关注以上D-氨基酸存在的原因, 进一步考察氨 基酸原料药纯度或合成工艺的影响因素。 免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可联系删除。 |
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