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angnay铜虫 (著名写手)
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[求助]
RNA干扰第3步（见下面内容） 为什么正反向片段都要扩增啊？
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1 确定基因中同源性小的片段做干扰载体的目的片段，防止干扰到材料中含有的其他同源基因； 2 确定干扰载体中可以用的2个酶切位点， 3 设计2对带有不同酶切位点的引物，分别扩增正、反向片段，并检查序列是否正确没有突变； 4 将正向片段连接到酶切过的干扰载体中，pcr鉴定； 5 再将反向片段连上去，pcr鉴定。 为什么第三步待干扰基因的正反向都要扩增啊？为什么要扩增反向？不是正向才是读码框的方向吗？ 谢谢大家~ |
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在一个特定的细胞中，基因的正义链和反义链都可能会被转录。不过，转录起始位点（TSS）通常只在一个方向上出现，因此主要的RNA转录一般都发生在正义链上。但是有时候，由于特定的调节机制或者紧急响应信号，基因的反义链也会被转录。 对于“忽略掉negative strand（3' -> 5'）上存在的同源片段”的描述可能有些不够准确。实际上，在同源片段比对分析时，如果正负义链间有一定的差异性，则基于RNA测序的分析可能会默认特定方向的表达量为零或极低水平。因此，在这种情况下负链（3' -> 5'）上存在的同源片段虽然也能够被测序检测到，但往往会被认为是低表达水平或者噪声，并未得到足够的重视。 以上回答来自Chat GPT 发自小木虫Android客户端 |
4楼2023-04-17 15:29:08
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您好，感谢您的提问。第三步中设计2对带有不同酶切位点的引物，分别扩增正、反向片段的目的是为了检查待干扰基因在反向链上是否存在同源基因。虽然基因组DNA序列通常是双链结构，但在实验过程中往往只考虑其中的一个单链，因为在PCR扩增过程中只需要一条模板链。 如果只扩增待干扰基因的positive strand（5' -> 3'），则可能会忽略掉negative strand（3' -> 5'）上存在的同源片段，这会导致未预期的干扰效果。因此在进行基因组编辑实验前，需要通过PCR扩增来验证引物是否特异性，以及确保干扰载体中插入的片段与目标基因匹配且精确无误。如果您有任何其他问题，请随时联系我。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2023-04-17 15:14:34
angnay
铜虫 (著名写手)
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3楼2023-04-17 15:25:02
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