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为什么高尔基染色法只能镀染百分之五的神经元，还被认为是很神奇的结果？
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为什么高尔基染色法只能镀染百分之五的神经元，还被认为是很神奇的结果？ 高尔基染色法第一次揭示了完整的神经元结构，并且恰恰是因为这种方法只能染一小部分神经元，才让人们可以清晰地看到神经元的结构以及这些神经元之间的联系。 原理： 用重铬酸钾和铬酸钾，氯化汞作为初步固定剂浸润组织，铬盐和神经细胞中的蛋白质结合，氯化汞通过白色沉淀来标记单个细胞，进一步经过碱处理，使沉淀物变黑(硫化汞)。该法最显著的特点是其反应终产物都局限于单个神经细胞的内部，而其周围去多类似的神经细胞不着色，从外观上看，就好像从固定到脱水的全过程在细胞膜水平都存在一个阻止可见产物扩散的屏障。 01 明胶玻片的制备 高尔基染色的脑片较厚，如果使用普通玻片贴片，在染色过程中，脑片很容易从玻片上脱落下来，影响实验结果，对此需制备特殊明胶包被载玻片，以供高尔基染色使用。 方法： 加热500mL双蒸水，后加入10g明胶，搅拌溶解。待溶解后加入0.5g硫酸铬钾，搅拌溶解(此步骤需在通风橱内进行)，定容至1L，过滤冷却至室温。将干净的玻片浸入溶液当中，避免气泡形成。37°C烤干玻片，烤干后4°C保存。 02 脑组织标本收集 1、在取脑前24小时提前等量混合AB液，并不能搅拌。制备好的浸泡液在用之前室温黑暗保存可长达一个月。每cm3待研究组织至少用5ml浸泡液。注意用较少的浸泡液可能降低染色的灵敏性和可靠性。 2、杀死动物之前对实验动物进行深度麻醉。应尽快地从颅骨中取出动物的脑(或死去病人的脑)，但操作时必须非常小心以免损伤或压迫组织。 3、用双蒸水快速冲掉组织表面的血液，把组织浸泡在由溶液A和B等体积混合的浸渍液中，室温下黑暗保存两周。浸泡6个小时以后或次日更换新的浸渍液。 4、转移组织到溶液C中室温黑暗至少72小时 (可长达1周)。24小时后或次日至少更换一次溶液。 03 冰冻切片 1、从C溶液中去除组织，擦除表面液体，置于-24°C切片机中的样本盘上滴加双蒸水包被冰冻。 2、使用修块(Trim)模式进行切片，切片厚度100-150um，按实际需要调整切片温度。 3、在写好标记的载玻片上滴一滴C液，可用毛笔涂开。用玻璃分针把样本转移到玻片上，使之在C液中展开，注意脑片与载玻片中间不能留有气泡。载玻片上多余的溶液用吸管吸走并用滤纸吸干(载玻片上的溶液必须尽可能地吸干否则切片将从载玻片上脱落下来)。切片可以室温下自然风干(不能用电风扇或电热板使其干燥)。为取得最佳结果，应尽快地完成切片，制备好的切片如果保存于载玻片盒中，室温黑暗条件下最长可保存3天。 04 高尔基染色 在染色过程中和盖盖玻片之前的任何一步都不要让切片变干。 1、用双蒸水冲洗切片两次，每次4分钟。 2、碱化： 把切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份的双蒸水组成的混合液中10分钟。比如:溶液D10ml溶液E 10ml双蒸水 20ml。 注意： 切片的工作液最好现配现用，每100mI工作液最多用于100张切片(比如小鼠脑)。盛有工作液的瓶子或染色罐必须盖好盖子防止试剂蒸发。为取得最佳结果，孵育期间应频繁搅拌工作液。 3、用蒸水冲洗切片两次，每次4分钟 (蒸留水应频繁更换新的)。 4、在50%，75%和95%的乙醇中对切片进行脱水，每个浓度梯度脱水4分钟 (不要跳过任何一个步骤)。 5、然后在无水乙醇中对切片进行脱水，4次，每次4分钟(不要延长时间)。 6、在二甲苯中诱明，3次，每次4分钟，并且用树脂封片剂对盖玻片进行封片。 7、避光晾干，拍照进行数据分析。。 |
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