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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于同源双交换敲除基因的问题
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keakye

铜虫 (初入文坛)

[交流] 关于同源双交换敲除基因的问题

求教各位大大，小弟用同源双交换法做一个基因的敲除，现在得到了这个基因的左同源臂和右同源臂的结合序列，该如何插入pEASY-Blunt载体？如何连接到pDS132上？如何抗性筛选一次整合的转化子？还有如何用5％蔗糖板筛选缺失突变体？

问题比较多，主要小弟基础比较差，请各位大大耐心指点，谢谢！
另外小弟是新虫，金币也不多，能帮上小弟的一定金币送上
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1楼 2009-09-23 17:23:25
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keakye

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-9-24 20:45:

搞明白了，把你的思路也分享一下啊，我还不太明白呢，

第一个质粒没有用，就是用来测序时当底版的
第二个质料是自杀型质粒，转入细胞后压力选择到基因组上
然后通过抗性筛选先筛掉没有质粒的细胞
再用蔗糖筛选出不含SacB的细胞，就是需要的类型了
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7楼2009-09-26 12:17:37
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
keakye(金币+1,VIP+0): 9-24 17:05
可能实验室命名的不同，能不能说下，你的这两个质粒哪个是含有重组系统的？应该是前一个吧！如果敲除的话只用一个同源充足质粒就可以了，你为什么用了两个呢？后一个质粒是用来干嘛的呢？
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2楼2009-09-23 22:56:47
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keakye

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-23 22:56:
可能实验室命名的不同，能不能说下，你的这两个质粒哪个是含有重组系统的？应该是前一个吧！如果敲除的话只用一个同源充足质粒就可以了，你为什么用了两个呢？后一个质粒是用来干嘛的呢？

我也是搞不清楚为什么用两个质粒，不过第一个质粒酶切位点是平末端的，第二个是粘末端的，同源重组时用的是第二个质粒，别的就不知道了。。
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3楼2009-09-24 08:39:52
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★
keakye(金币+1,VIP+0): 9-24 17:05
你能把pDS132图谱发上来么？用蔗糖筛选，是不是载体上有SacB基因？同源双交换就是需要用两个同源臂。还有，第一个是不是相当于T载之类的载体？
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4楼2009-09-24 08:51:07
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