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keakye

铜虫 (初入文坛)

[交流] 关于同源双交换敲除基因的问题

求教各位大大,小弟用同源双交换法做一个基因的敲除,现在得到了这个基因的左同源臂和右同源臂的结合序列,该如何插入pEASY-Blunt载体?如何连接到pDS132上?如何抗性筛选一次整合的转化子?还有如何用5%蔗糖板筛选缺失突变体?

问题比较多,主要小弟基础比较差,请各位大大耐心指点,谢谢!
另外小弟是新虫,金币也不多,能帮上小弟的一定金币送上
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)


keakye(金币+1,VIP+0): 9-24 17:05
你能把pDS132图谱发上来么?用蔗糖筛选,是不是载体上有SacB基因?同源双交换就是需要用两个同源臂。还有,第一个是不是相当于T载之类的载体?
4楼2009-09-24 08:51:07
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


keakye(金币+1,VIP+0): 9-24 17:05
可能实验室命名的不同,能不能说下,你的这两个质粒哪个是含有重组系统的?应该是前一个吧!如果敲除的话只用一个同源充足质粒就可以了,你为什么用了两个呢?后一个质粒是用来干嘛的呢?
2楼2009-09-23 22:56:47
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keakye

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2009-9-23 22:56:
可能实验室命名的不同,能不能说下,你的这两个质粒哪个是含有重组系统的?应该是前一个吧!如果敲除的话只用一个同源充足质粒就可以了,你为什么用了两个呢?后一个质粒是用来干嘛的呢?

我也是搞不清楚为什么用两个质粒,不过第一个质粒酶切位点是平末端的,第二个是粘末端的,同源重组时用的是第二个质粒,别的就不知道了。。
3楼2009-09-24 08:39:52
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keakye

铜虫 (初入文坛)

今天问同学搞明白了,谢谢楼上几位了,呵呵
不管怎么说,金币奉上
5楼2009-09-24 17:05:30
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