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gentledragon

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助】微粒体体外代谢实验技术细节问题关于孵育

请教各位大侠：
本人目前在进行大鼠的肝微粒体体外代谢的抑制实验，微粒体购自sigma，各种亚酶抑制剂购自sigma或阿拉丁。
孵育步骤：
首先，配置tris缓冲液0.15mol/L,含5mmol的mgcl2，pH7.4
第二，取微粒体（溶于缓冲液）1.13636mg/mL 440uL，加入5mM/L的底物 5uL,加入抑制剂酮康唑5uL（5mM/L），以上体系中最后加入NADPH 50uL （ 20mmol/L）。然后37度孵育1h。反应后，萃取出底物，看底物被代谢的程度，但最后发现，无论是加抑制剂组和不加抑制剂组均未发现代谢发生，底物未见量降低。而文献报道次底物可被代谢。请指教我的实验中的问题和错误。
缓冲体系中是否需要加入其他必的东西呢？

[ Last edited by gentledragon on 2009-9-22 at 10:05 ]

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风一样的u然自得

1楼 2009-09-20 10:24:38

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wendao

木虫 (小有名气)

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★
karl2100(金币+1,VIP+0):谢谢回复！ 9-27 00:46

引用回帖:

Originally posted by gentledragon at 2009-9-20 10:24:
请教各位大侠：
本人目前在进行大鼠的肝微粒体体外代谢的抑制实验，微粒体购自sigma，各种亚酶抑制剂购自sigma或阿拉丁。
孵育步骤：
首先，配置tris缓冲液0.15mol/L,含5mmol的mgcl2，pH7.4
...

MgCl2作用是提供Mg离子,酶促反应催化因子,其实有些商业化的微粒体溶液中本身也含有MgCl2