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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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gentledragon

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】微粒体体外代谢实验 技术细节问题 关于孵育

请教各位大侠:
        本人目前在进行大鼠的肝微粒体体外代谢的抑制实验,微粒体购自sigma,各种亚酶抑制剂购自sigma或阿拉丁。
孵育步骤:
    首先,配置tris缓冲液0.15mol/L,含5mmol的mgcl2,pH7.4
    第二,取微粒体(溶于缓冲液)1.13636mg/mL 440uL,加入5mM/L的底物  5uL,加入抑制剂酮康唑5uL(5mM/L) ,以上体系中最后加入NADPH 50uL            ( 20mmol/L)。然后37度孵育1h。反应后,萃取出底物,看底物被代谢的程度,但最后发现,无论是加抑制剂组和不加抑制剂组均未发现代谢发生,底物未见量降低。而文献报道次底物可被代谢。请指教我的实验中的问题和错误。
缓冲体系中是否需要加入其他必的东西呢?

[ Last edited by gentledragon on 2009-9-22 at 10:05 ]
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风一样的u然自得
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无刺头刺猬

银虫 (小有名气)


gentledragon(金币+1):谢谢参与
楼主,我也做过抑制,你做的是一相反应,我也是,不过我没加MGCL2
2楼2009-09-25 10:33:27
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wendao

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你是用HPLC测定底物量? 你的底物浓度太高了,既然底物是已知化合物,查文献按照文献条件做, 你的抑制剂浓度也高了
3楼2009-09-26 22:33:41
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wendao

木虫 (小有名气)


karl2100(金币+1,VIP+0):谢谢回复! 9-27 00:46
引用回帖:
Originally posted by gentledragon at 2009-9-20 10:24:
请教各位大侠:
        本人目前在进行大鼠的肝微粒体体外代谢的抑制实验,微粒体购自sigma,各种亚酶抑制剂购自sigma或阿拉丁。
孵育步骤:
    首先,配置tris缓冲液0.15mol/L,含5mmol的mgcl2,pH7.4
     ...

MgCl2作用是提供Mg离子,酶促反应催化因子,其实有些商业化的微粒体溶液中本身也含有MgCl2
4楼2009-09-26 22:37:33
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