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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 【求助】微粒体体外代谢实验 技术细节问题 关于孵育
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gentledragon

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】微粒体体外代谢实验 技术细节问题 关于孵育

请教各位大侠：
        本人目前在进行大鼠的肝微粒体体外代谢的抑制实验，微粒体购自sigma，各种亚酶抑制剂购自sigma或阿拉丁。
孵育步骤：
    首先，配置tris缓冲液0.15mol/L,含5mmol的mgcl2，pH7.4
    第二，取微粒体（溶于缓冲液）1.13636mg/mL 440uL，加入5mM/L的底物  5uL,加入抑制剂酮康唑5uL（5mM/L） ，以上体系中最后加入NADPH 50uL            （ 20mmol/L）。然后37度孵育1h。反应后，萃取出底物，看底物被代谢的程度，但最后发现，无论是加抑制剂组和不加抑制剂组均未发现代谢发生，底物未见量降低。而文献报道次底物可被代谢。请指教我的实验中的问题和错误。
缓冲体系中是否需要加入其他必的东西呢？

[ Last edited by gentledragon on 2009-9-22 at 10:05 ]
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风一样的u然自得
1楼 2009-09-20 10:24:38
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无刺头刺猬

银虫 (小有名气)
★
gentledragon(金币+1):谢谢参与
楼主，我也做过抑制，你做的是一相反应，我也是，不过我没加MGCL2
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2楼2009-09-25 10:33:27
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wendao

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你是用HPLC测定底物量? 你的底物浓度太高了,既然底物是已知化合物,查文献按照文献条件做, 你的抑制剂浓度也高了
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3楼2009-09-26 22:33:41
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wendao

木虫 (小有名气)
★
karl2100(金币+1,VIP+0):谢谢回复！ 9-27 00:46
引用回帖:
Originally posted by gentledragon at 2009-9-20 10:24:
请教各位大侠：
        本人目前在进行大鼠的肝微粒体体外代谢的抑制实验，微粒体购自sigma，各种亚酶抑制剂购自sigma或阿拉丁。
孵育步骤：
    首先，配置tris缓冲液0.15mol/L,含5mmol的mgcl2，pH7.4
     ...

MgCl2作用是提供Mg离子,酶促反应催化因子,其实有些商业化的微粒体溶液中本身也含有MgCl2
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4楼2009-09-26 22:37:33
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