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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 最近做酶切为什么质粒老是别切碎啊
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 最近做酶切为什么质粒老是别切碎啊

最近在做实验室，用xbal 1和kpn1做双酶切为什么老是切碎了，我用的体系是 50ul，其中30ul质粒，这两种酶各1ul，期待各位的帮助
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1楼 2009-09-17 13:44:05
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
★
huangdi07(金币+1,VIP+0): 9-17 15:42
时间太长了吧？
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2楼2009-09-17 13:58:20
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
★
huangdi07(金币+1,VIP+0): 9-17 15:42
我决的最有可能的就是你的质粒上有还有其他的这两种酶的酶切位点，你可以再看一下；还有可能就是你酶切的时间太长了。你酶切的时间是多少？
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3楼2009-09-17 14:02:12
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
质粒就切了两个小时啊，pcr产物过夜切然后第二天又补加酶切了两个小时，结果pcr片段没碎，质粒碎了
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4楼2009-09-17 15:42:19
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
那你看看你的质粒上是不是还有这两种酶的酶切位点。
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5楼2009-09-17 16:10:03
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寒山拾得

木虫 (小有名气)
★ ★
huangdi07(金币+2,VIP+0): 9-17 22:52
你我可以把酶量减半试试。我用takala的也遇到过这样的问题，我一般把酶减半，然后1U酶切两ug质粒37度一小时。就可以了。
最好你把图贴上看看。同时做单酶切也是必须的。
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6楼2009-09-17 16:30:40
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caike6326

铁虫 (初入文坛)
★
huangdi07(金币+1,VIP+0): 9-17 22:52
酶量太大了，甘油浓度高，出现星号活性了。
降低酶浓度应该就可以了
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7楼2009-09-17 16:39:12
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
过去碰到过几次，质粒完全被切散，电泳完全弥散
第一次后来发现时某个酶或者buffer 污染了，换了新酶和buffer就没问题
第二次是质粒提取的问题。有次提质粒正好去蛋白液用光了，就直接用了washing buffer(说明书上写可以这样做)，结果酶切就弥散了。有趣的是好像跟酶有关，用PST1 弥散但是ECOR1就没事
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8楼2009-09-19 21:29:23
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
我做时也是跟楼上一样的情况，有的酶可以切开 有的酶就直接切碎了，我用的是博彩的酶  他们代理的是俄罗斯生产的Promega的酶，不知道质量怎么样 a
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9楼2009-09-20 09:08:51
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小瞥

铁虫 (小有名气)
第一，可能是载体上还有其他的酶切位点，你需要再确认这个问题。
第二，可能是时间酶切太长了，产生了star activity,减短酶切时间
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10楼2009-09-20 13:44:07
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