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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 插入EGFP片段不发荧光
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X似水流年X

新虫 (小有名气)

[求助] 插入EGFP片段不发荧光 已有1人参与

请问我将EGFP片段替换掉细菌一个基因的终止密码子，构建成融合蛋白，想观察它的荧光情况，可是根本看不见荧光怎么办，我已经筛选出插入成功的了，而且提取总rna验证EGFP片段已经插入进去，可是就是不发荧光，是因为融合蛋白阻碍发光吗

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1楼 2022-12-30 20:30:29
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
你可能没有构建好吧，获得的是单交换突变体

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2楼2022-12-31 22:43:42
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X似水流年X

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2022-12-31 22:43:42
你可能没有构建好吧，获得的是单交换突变体

你好，是这样我已经通过蔗糖第二次筛选，然后验证的时候是单条带，和我构建质粒上的片段长度一致，请问是我这种插入方法有问题吗

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3楼2023-01-04 22:12:31
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
是不是插入位点的问题

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4楼2023-01-05 20:49:43
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X似水流年X

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biosci at 2023-01-05 20:49:43
是不是插入位点的问题

可能是的，我再换个位置

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5楼2023-01-06 14:46:44
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
建议看看文献，多选几个整合位点

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6楼2023-01-10 22:24:08
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X似水流年X

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biosci at 2023-01-10 22:24:08
建议看看文献，多选几个整合位点

好的，非常感谢

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7楼2023-01-11 00:54:06
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hutil1543

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有可能是蛋白可溶性被破坏了，不可溶的情况下会出现没有荧光的情况。
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8楼2023-02-02 10:17:54
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