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动物模型 | 脑瘫动物模型的构建及评价
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脑性瘫痪（cerebral palsy，CP）简称脑瘫，是由各种原因所引起的婴儿在出生前后一个月内出现颅脑损伤或发育缺陷，进而导致的姿势异常或者运动障碍，属于非进行性脑损伤。目前，脑瘫已成为儿童致残的主要疾病之一。成功地建立近似于人类脑瘫脑损伤机制与临床表现的动物模型是深入研究其发病机制，进行有效干预的基础。 根据脑瘫的病因学假说，目前脑瘫模型制备方法大致有缺血缺氧型、感染型、神经毒素型、脑外伤型、多法联合型五种。 动物的选择 多脑回动物如狗、猪、羊、兔等因体积较大、饲养相对困难、费用较贵等原因限制了其在实验中的大量应用; 与人类最接近的灵长类动物则更加昂贵和稀少，不适应实验研究应用; 非多脑回动物如鼠类体形小、数量大、价格便宜、易饲养，行为表现多样，情绪反应敏感，且其脑体积小便于脑组织病理变化和生化改变的观察。因此目前国内外大多倾向采用大鼠作为脑瘫模型动物。 造模方法 一、缺血缺氧模型 缺血缺氧模型是比较常用的脑瘫动物模型，主要有以下三种造模方式。 1 单侧颈动脉结扎法 造模方法1：研究者将3日龄幼鼠结扎单侧颈总动脉后暴露于8%O2缺氧环境中1.5 h，连续观察幼鼠行为学表现33天，结果发现幼鼠出现显著生长障碍，转圈等异常行为明显增多。 造模方法2：研究者通过结扎7日龄幼鼠右侧颈动脉2h后，置于37℃恒温的密闭缺氧箱中2 h后取出，结果显示幼鼠出现了脑部损伤，病理表现符合缺血缺氧性脑病的特征。 优点：单侧颈动脉结扎法被认为最为成熟的是大鼠单侧颈总动脉结扎合并缺氧环境制作的动物模型，其成功率高，易于操作，重复性好，实验结果稳定可靠，是运用较为广泛的脑瘫动物模型。 缺点：单侧颈动脉结扎法不能模拟由于产前因素造成的胎儿宫内缺氧。 2 双侧颈动脉结扎法 造模方法1：研究者选取出生4d的幼鼠给予双侧颈动闭塞，在出生第6天时对脑组织进行病理学检测，发现内囊周围白质出现囊性损伤和凝固性坏死。这种改变与脑瘫发生的时间点有些差别，但可以在制作脑瘫模型时作为一种参考。 造模方法2：研究者选取清洁级5日龄Wistar新生大鼠，结扎两侧颈总动脉，30日龄时进行神经行为学和脑组织病理学检测，发现模型幼鼠脑组织病理学和神经行为学变化大致符合脑瘫标准。 1 子宫动脉结扎 造模方法：研究者将孕18周大鼠麻醉后行腹中线切口，暴露4条子宫动脉后同时阻断血流45min。在不同的时间段采集幼鼠脑组织进行组织学检查，以鉴定造模是否成功。 二、感染模型 1 腹腔内感染模型 造模方法1：研究者给予孕16d、17d的大鼠腹腔注射脂多糖（LPS），每次350μg/kg，连续2d。出生30d的仔鼠神经行为学检测和脑组织病理学检查结果显示模型组大鼠随意运动障碍，姿势、肌张力异常；脑损伤部位在白质，系胶质细胞、髓鞘的损伤。 造模方法2：研究者将孕16-18天健康 Wistar大鼠腹腔注射LPS 0.4 mg/kg，12h后置于缺氧环境中缺氧2.5 h，4h后再次腹腔注射LPS 0.4 mg/kg。在乳鼠出生4周后进行行为学、神经电生理及脑组织病理学检测。 优点：腹腔内注射脂多糖模型旨在反应内毒素对脑白质的局部损害，与脂多糖的局部浓度密切相关。应用孕鼠腹腔注射LPS致宫内感染合并缺氧的方法更为成熟，对运动功能的损害较小，具有简单易行、能够逼真模拟人类在怀孕晚期宫内感染缺氧致胎儿脑部损伤等优点，为脑瘫的实验研究提供了理想的动物模型，值得推广。 2 宫内感染模型 造模方法1：研究者给孕17天的大鼠宫内注射LPS 而诱发早产现象，后续研究也证明炎症反应学说是引起早产儿发生脑瘫的重要因素。 造模方法2：研究者选取孕15天的Fischer344 鼠给予子宫内注射LPS 1mg/kg，在自然分娩后1～21天之间对幼鼠进行神经行为学检测和组织病理学检查，以确定造模是否成功。 造模方法3：研究者给予孕28～31天的白兔宫腔内注射LPS 20 μg/kg，出生后幼兔神经行为学和脑组织病理学检测结果显示LPS可导致模型幼兔脑白质的损伤和运动功能障碍。 三、神经毒素模型 1 胆红素模型 造模方法：研究者给予出生24h内的仔兔腹腔注射胆红素300 mg/kg，常规哺育45天后进行神经行为学检查和病理学检测，发现可造成仔兔脑损伤并致脑瘫。 2 甲基汞模型 造模方法：研究者在大鼠孕后的12d、13d、14d分别向脑室内注射甲基汞5mg/kg来制作脑瘫模型。造模后在幼鼠出生后1d、15d、30d 分别采集脑脊液及脑组织，检测S100B浓度。 3 三硝基丙酸模型 造模方法：研究者选取出生5天的大鼠注射三硝基丙酸，并在注射后的1d、2d、3d、9d进行脑组织病理学检测，发现模型大鼠脑组织改变较广泛，具体可见白质与大脑皮质的损伤，胼胝体萎缩，脑室扩张等。 四、脑外伤模型 此种造模方法有脑组织切除法、液压冲击法、加速致伤法、自由落体打击法、各种脑组织破坏法等。诸多方法中以自由落体打击法和液压冲击法相对成熟，应用较广泛。 造模方法1：研究者利用液压冲击的方法迅速地向大鼠颅腔内注射一定量的液体，致使大鼠颅腔内的压力骤然增加，引起脑组织的弥散性受损。 造模方法2：研究者设计一种自由落体打击装置来撞击致脑损伤以制作模型。 方法1和方法2的缺点：这两种造模方法被认为是比较经典的脑外伤致脑瘫模型，但是其所致脑瘫的症状持续时间均相对较短，因此只适合做为脑损伤急性期的研究。 造模方法3：研究者运用脑组织部分切除的方法制作痉挛型脑瘫模型，造成的脑损伤在神经解剖学上与痉挛型脑瘫的病理解剖改变比较接近，出现的痉挛型脑瘫体征维持时间亦较长。 造模方法4：研究者采用电毁损锥体束法致大鼠一侧肢体痉挛性脑瘫，结果成功制备了稳定性较高的具有痉挛性瘫痪症状的脑瘫模型。 五、多法联合模型 多法联合模型就是将两种以上的造模方法联合应用，从多角度呈现脑瘫多因素致病的特点。 造模方法1：研究者先向幼鼠脑池中注射LPS后，进行颈内动脉结扎，然后再置于低氧环境来联合制作脑瘫模型。并且认为此种造模方法能明显加重模型鼠脑组织损伤的程度。 造模方法2：研究者采用孕鼠体内注射LPS的方法造成宫内感染，再对幼鼠运用缺血缺氧法制作脑瘫模型，结果显示模型幼鼠的强迫性和自主性运动明显异常，同时模型动物双侧大脑半球的皮质、皮质下，以及附近白质、豆状核和黑质均有损伤。 脑瘫动物模型的鉴定 有效地对模型进行鉴定才能判断模型制作的成功性，才能提高实验数据的可信度。采用的检验动物模型常用方法有以下几点： 1 神经行为学检测 目前脑瘫的诊断主要依靠其特征性的临床表现，即空间学习认知能力、运动功能的损害，姿势的异常等，检测方法主要有Morris水迷宫、足印重复间距分析试验、平衡木试验等。水迷宫中大鼠需要对迷宫周围物体的空间位置进行比较评价，从而学会寻找及记忆迷宫中平台的位置，爬上平台，逃避溺死，Morris水迷宫是测验大鼠学习和记忆尤其是空间记忆的比较可靠的方法 。此外，应用足印步态重复间距、平衡木试验对脑瘫动物模型生物学行为检验，研究结果显示模型组足印步态重复间距、平衡木通过时间以及后足脱落次数均与正常组有差异，脑瘫鼠肢体存在行动迟缓、运动障碍。 2 病理形态学 组织病理学检测可以客观直观的获取到组织形态学图片，可以清晰的观察到脑皮层细胞排列是否整齐，轮廓是否清晰，结构是否完整以及有无异型性细胞等等。 3 神经电生理检测 神经电生理方法对脑瘫的检测近年来得到了飞速的发展。有研究者对小鼠进行皮质微电极刺激并绘图，结果显示感觉运动受限组的动物80%一级皮质定位点支配臀部运动，缺血组这一数据为57.1%，均高于对照组，提示痉挛状态的再现。 4 分子生物学指标 由于缺氧缺血或宫内感染等可激活受损局部的星形细胞和小胶质，它们产生多种细胞因子，并与血液中渗入的白细胞一起对这些细胞 因子产生应答，进而损害脑白质组织的星形细胞、少突胶质以及轴突等，最终导致脑白质组织的坏死、星形 胶质化、细胞凋亡以及囊腔形成等多种病理改变 。分子生物学指标的测定也为后续细胞移植与基因治疗脑瘫提供了理论依据。 总结 目前尚没有能够模拟各种类型脑瘫公认的、理想的动物模型。每一种动物模型都有其优势与不足。研究者应根据自身的研究方向和侧重点来选择与之相适应的实验动物模型。 |
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