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动物造模 | 肺纤维化动物模型
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肺纤维化（ pulmonary fibrosis，PF）是一种间质性肺疾病，以巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞在肺间质浸润、纤维母细胞增生及纤维结缔组织沉积于肺间质致使出现弥散性肺泡炎和肺泡结构紊乱，并最终导致肺间质纤维化为特征，是一系列慢性肺部疾病的最终结局。因为肺纤维化的体外研究受到条件的限制，目前基本没有合适的研究方法，因此建立与人肺纤维化病理过程相似的动物模型尤为重要。 动物的选择 目前，肺纤维化动物模型有采用体型较小鼠类（如小鼠、大鼠、仓鼠等）和兔。其中 C57BL/6 小鼠、BALA/C 小鼠、KM 小鼠和 ICR 小鼠，Wistar 大鼠和SD 大鼠是用于肺纤维化模型最常用的种类，也有选用体型较大的犬、猪、羊和灵长类动物等，模型选用的动物种类因研究目的和造模方法不同而异。 鼠类是较多选用的肺纤维化动物模型，体型小、体重轻、价格便宜，有气管灌注、雾化吸入、经鼻给药、腹腔注射、静脉注射等多种给药方式，是常用的造模动物，但因其体型太小不适用于放射影像学的研究，需要通过解剖摘取肺部进行组织病理学检查的方法判断造模是否成功。 猪、猴等大型动物体型大，心脏及肺部组织结构与人相似，并且可通过影像学方法在无创条件下动态观察动物造模情况，但价格昂贵，操作较复杂。 造模方法 目前已建立多种诱发动物肺纤维化模型的方法，包括基因相关模型与非基因相关模型。基因相关模型是指通过基因工程使动物成为肺纤维化模型，而非基因相关模型是指在相同或相似的遗传背景下，通过环境因素、药物毒物或其他因素诱导得到的肺纤维化模型。 一、基因相关方法致肺纤维化模型 转基因方法包括细胞因子过表达法、靶向Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤法。 1 SD大鼠细胞因子过表达法致肺纤维化模型步骤 前期准备：AdTGF-β1223/225 及腺病毒空载体 -70℃保存，临用前经病毒稀释液稀释成 1×109pfu（病毒稀释液由三种溶液构成，其配制方法：A 液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.15 g，KH2PO4 0.2 g，加双蒸水定容至100 mL，高压消毒；B 液：CaCl2·2H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高压消毒；C 液：MgCl2·6H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高压消毒。用前取 98 mL A 液、1 mL B 液、1 mL C 液混合备用。 操作步骤：选用 SD 大鼠，体质量（250±15） g，腹腔注射速眠新麻醉（0.4 mL·kg-1），无菌操作，剪开颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉，充分暴露气管，经喉头下一次性注入 0.4 mL AdTGF-β1223/225 腺病毒液，手术 6 h 后观察并记录动物生理反应。 模型验证：分别与造模后 d 7、d 14、d 21，麻醉后开胸，左心室插管，先灌流温热（室温）生理盐水，剪开右心耳放血，待流出液变澄清后再缓慢灌流 4% 多聚甲醛水溶液（200 mL·30 min-1）。小心摘取整个肺和心，经气管恒压（2 452 Pa）灌注 4% 多聚甲醛固定液 10 min，使肺泡恢复扩张状态。沿纵轴切取肺组织浸入 4% 多聚甲醛固定液中固定 24 h，做常规石蜡包埋、石蜡切片、HE 染色和 Mallory 染色，光镜观察、摄片。 2 靶向Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤法 靶向Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤法是利用转基因技术将白喉毒素受体与Ⅱ型肺泡上皮细胞启动子通过载体融合，白喉毒素不断刺激转基因小鼠，致肺纤维化。通过敲除特定基因或导入突变基因使基因突变也能建立肺纤维化动物模型，与肺纤维化有关的基因包括：肺表面活性蛋白C、肺表面活性蛋白A2（SFTPA2）、端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶 RNA复合酶（TERC）。 转基因方法的优势：基因技术造模方法比较于传统造模方法，靶点明确，对筛选抗纤维化药物意义重大。除此之外，通过诱导时间特定启动子，可模拟肺纤维化晚期出现的临床症状。 转基因方法的劣势：介导转基因用的病毒载体本身具有潜在危害性，且人类肺纤维化是多基因多种因子作用的结果，因此单一的基因模型与多基因相关的肺纤维化模型存在一定差异。 二、非基因相关方法致肺纤维化模型 常用的非转基因方法主要为物理化学方法，包括博莱霉素诱导法、平阳霉素诱导法、百草枯诱导法、石棉诱导法、辐射诱导法。化学诱导法及石棉诱导法通常通过皮下、静脉注射，或者雾化吸入等途径给药，辐射诱导法则直接进行射线照射。 1 博莱霉素致肺纤维化模型 目前博莱霉素诱导肺纤维化有气管内一次给药或多次给药，也有腹腔给药、鼻内给药、静脉给药、雾化吸入多种方式。气管内一次给药是最常用的造模方式。 1.1 大鼠气管内注射博莱霉素致肺纤维化模型 步骤：选用健康雄性8~10 周龄 Wistar 大鼠，体质量（250±50）g，用 10% 水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧固定于实验台，开口器固定口腔，拉出舌，用压舌板压舌腹，在额镜直视下，趁动物吸气瞬间迅速行气管插管（Ф 2 mm，4~5 cm），缓慢注入 5 mg·kg-1BLM 0.2~0.3 mL，立即旋转动物，使药液在肺内均匀分布，自由饮水、摄食，d 1、d 14、d 28 采集标本。 特点：气管内一次给药法有给药次数少、剂量小、制模时间短等优点，但动物死亡率较高，操作复杂，急性肺损伤程度重、胶原代谢紊乱的程度轻，病灶分布不均，以支气管周围为显著的特点。目前一次性气管内灌注博莱霉素诱导的动物肺纤维化是国内外最常用、最受认可的肺纤维化模型。 1.2 仓鼠气管内注射博莱霉素致肺纤维化模型 步骤：取10 周龄雄性叙利亚仓鼠，用生理盐水配制 1 U 博莱霉素溶液，单次气管内注射 0.1 mL，注射药物 3 周后，取肺组织进行细胞原代培养，3H-TdR 整合实验评估成纤维细胞增殖效果。 特点：气管内一次给药法有给药次数少、剂量小、制模时间短等优点，但动物死亡率较高，操作复杂，急性肺损伤程度重、胶原代谢紊乱的程度轻，病灶分布不均，以支气管周围为显著的特点。目前一次性气管内灌注博莱霉素诱导的动物肺纤维化是国内外最常用、最受认可的肺纤维化模型。 1.3 大鼠腹腔内注射博莱霉素致肺纤维化模型 步骤：选用健康雄性 8~10 周龄 Wistar 大鼠，体质量（250±50）g，每日腹腔注射 15 mg·kg-1 BLM 10 天，自由饮水、摄食，d 1、d 14、d 28 采集标本。 特点：腹腔内给药法具有给药次数多、剂量大、制模时间长等缺点，但动物死亡率相对较低，且操作简便，急性肺损伤程度较轻、胶原代谢紊乱的程度较重，病灶分布均匀，以胸膜下为显著的特点。 1.4 小鼠鼻腔滴入博莱霉素致肺纤维化模型 步骤：选用 SPF 级雌性 ICR 小鼠，6~8 周龄，体质量16~18 g，适应性饲养 1 周后，鼻腔滴注博莱霉素造模。用乙醚麻醉小鼠，后用微量移液器吸取 50 μL 博莱霉素溶液（15 mg·kg-1 进行干预），经鼻腔缓慢滴入小鼠气管内，放入鼠笼内安置，观察其造模后一般情况。 2 平阳霉素致肺纤维化模型 平阳霉素是一种抗肿瘤抗生素，具有肺毒性，文献中通常采用大小鼠气管注射或雾化吸入的方式建立肺纤维化模型。 2.1 大鼠气管穿刺注入平阳霉素致肺纤维化模型 步骤：选用SPF级SD大鼠，体质量（200±20）g，将平阳霉素用生理盐水配成 5 g·L-1 的溶液。10% 水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）麻醉大鼠，颈部皮肤消毒，剪去颈部鼠毛，行颈正中切口，分离暴露气管，经气管软骨环间隙向心端穿刺，注入平阳霉素 5 mg·kg-1，立即将动物直立并旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，缝合皮肤，自由饮水、摄食，保持自然光照，d 28 采集标本。 2.2 大鼠雾化吸入平阳霉素致肺纤维化模型 步骤：将 Wistar 大鼠，体质量（200±20） g，放入长、宽、高各 40 cm 玻璃缸内，玻璃缸与超声雾化器相连通，通过雾化管向缸内喷入雾化液，缸上盖薄塑料板，板上留一个小的通气孔。将平阳霉素和生理盐水配成2 mg·mL-1的溶液，雾化吸入10 min。自由饮水摄食，d 28 采集标本。 3 百草枯致肺纤维化模型 3.1 小鼠口服百草枯致肺纤维化模型 步骤：有研究表明，昆明小鼠口服百草枯的 LD50 为 137.3 mg·kg-1，给予百草枯后小鼠全部存活的最高剂量为 100 mg·kg-1，故确定百草枯的给药剂量为 100 mg·kg-1。KM 小鼠，体质量（20±2）g，禁食 16 h 后，一次性灌胃 20% 百草枯水溶液后正常进食、饮水。 4 石棉微粒致肺纤维化模型 石棉纤维经气管内单次灌注给药（<5 μm 直径的石棉颗粒）是一种相对快速的纤维化造模方式，操作简便、快速、成功率高。 4.1 大鼠肺注入石棉微粒致肺纤维化模型 步骤：取石棉成品，经研磨，用 200 目钢筛滤过、水选，制备石棉微粒。95% 以上石棉粉尘微粒直径 <5 μm，用生理盐水配成 20 mg·mL-1 的浓度，经高压灭菌备用。选用Wistar大鼠，雌性，体质量（180~200）g，将 Wistar 大鼠置密封罐中，滴入乙醚，待充分麻醉后，将 20 mg·mL-1 的石棉生理盐水 1 mL，人耳镜插入大鼠气管开口，确认声带活动后，用腰分针（折去头），直接注入肺内，轻揉双肺片刻。在 2、4、6、8 周分别处死后，立即取大鼠肺、心、肝、肾等组织浸泡在福尔马林内。 5 辐射诱导法致肺纤维化模型 5.1 大鼠辐射诱导法致肺纤维化模型 步骤：选用雌性Wistar大鼠，体质量（220±20）g，无异常者进行 60 Coγ射线全胸单次照射，照射野为4.5 cm×4.0 cm，照距为3 m，剂量率为2.7 Gy·min-1，剂量为30 Gy。照射时，将大鼠上至两腋窝、下至胸骨剑状突的位置对准此照射野，用 10 cm 厚铅砖屏散装置屏蔽大鼠其余部分，照射后随机分笼喂养。分别于照后 3、7、14、21、28、42、56、70、90、180、270、365d 共 12 个时间点进行取材观察。取各时间点肺脏经病理宏观检查后，固定于 12%缓冲中性福尔马林中，用常规法制成石蜡切片，经 HE染色后进行光镜观察。 总结 动物模型是研究肺纤维化的重要工具，目前还没有一种肺纤维化模型能完全模拟临床肺纤维化病理特点，但利用现有的肺纤维化模型，我们能通过不同类型的肺纤维化模型了解肺纤维化不同特点，筛选更敏感的模型。随着技术进步和研究的改进，我们也会建立更符合临床肺纤维化病理特征的动物模型。 文献： [1]张丹参,马佳呈.诱发肺纤维化动物模型方法及评价[J].神经药理学报,2019,9(06):15-20. [2]郭琦琦,李毅,翁桓泽,王倩,贾敏.生物及非生物因素诱导肺纤维化动物模型研究的特点[J].中国组织工程研究,2022,26(14):2273-2278. |
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