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获得性再生障碍性贫血的造模研究
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再生障碍性贫血（ＡＡ）是一种常见的骨髓造血功能衰竭性疾病，常因暴露于有毒的化学物质、药物过量、射线辐射、病毒感染等损坏骨髓造血细胞及组织，引起外周血三系减少，出现严重的贫血、中性粒细胞减少症和血小板减少症等 ＡＡ 包括先天性 ＡＡ 以及获得性 ＡＡ。先天性 ＡＡ 多与 ＦＡ 基因突变有关，而获得性 ＡＡ 则多与造血干细胞（HSC）减少、造血微环境损伤和 Ｔ 淋巴细胞功能紊乱有关。目前，ＡＡ 的主要治疗手段为免疫抑制治疗以及造血干细胞移植治疗。ＡＡ 动物模型的建立对ＡＡ 发病机制的研究及有效药物的筛选具有重要意义。获得性 ＡＡ 为最常见的全血减少性疾病，可有出血、贫血、感染等症状。主要的发病机制为HSC受损、造血微环境异常和免疫功能紊乱，针对以上３种发病机制，大体有以下几种建立获得性 ＡＡ 动物模型的方法。 造模方法 物理方法 辐射作用于机体后，最早出现形态变化的是造血系统，由于骨髓组织增殖旺盛，分化程度低，对放射线高度敏感，骨髓损害程度取决于放射剂量的大小、照射范围、部位和照射时间等。射线辐射除了损伤造血干细胞外，还可损伤造血微环境，影响干细胞的增殖和分化。射线能阻止 DNA 的复制而抑制细胞有丝分裂，减少造血干细胞数量，其微环境的改变往往在相当时间内得不到恢复。同时引起免疫功能的严重损伤。 射线辐射复制 AA 动物模型多采用60 Co-γ 射线照射，60 Co-γ 射线辐射能够诱发产生自由基，促进造血细胞凋亡，引起细胞周期紊乱，造血干、祖细胞数量和增殖能力下降，造成骨髓损伤。但近十年来鲜有单独采用射线照射的方法来进行 AA 的模型制作。因其需要特殊设备，特殊防护，操作不方便，辐射剂量难以控制，过小达不到骨髓永久性损伤要求，过大又会导致动物死亡，有时药物的作用难以观察。所以现在射线照射多与化学药物相结合进行造模。 化学方法 苯剂作为最早应用于 ＡＡ 造模的试剂之一，可导致多品系小鼠造血功能异常，多用于研究苯中毒后 骨髓造血衰竭动物模型。苯在机体内产生的有毒代谢产物作用于骨髓基质细胞，使之不能分泌促进造 血细胞增殖的细胞因子；同时影响造血细胞的生长、基因表达和凋亡。随着研究的不断进展，越来越多的化学试剂用于建立获得性 ＡＡ动物模型。 分别于第 1、3、8、11、15、18、21、23 天，给予BALB/c 小鼠腹腔注射白消安 10.50 mg /kg，每天 1 次，共 8 次，造成小鼠骨髓长期抑制模型，该模型骨髓造血功能不能恢复正常，从造模后第 1 天直至造模后第 112 天，外周血红细胞、白细胞、血小板数、骨髓有核细胞数以及红系、粒单系、淋巴系造血祖细胞数均低于正常。此方法导致动物体内造血干细胞功能缺陷，可建立骨髓永久性抑制(再生障碍性贫血) 小鼠模型。 白消安是在临床上广泛用于异体骨髓移植后的药物，然而，若使用不当，其血液毒性会引起骨髓衰竭。同理，环磷酰胺也因其细胞毒性在一些情况下可引起ＨＳＣ受损等。有研究者采用连续１２ｄ环磷酰胺联合白消安腹腔注射雄性ICR小鼠的方法建模。结果显示ＡＡ组白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板以及骨ＢＭＮＣ分别下降了64.32％、42.3％、20.04％、61.53％和68.35％；骨髓组织可见脂肪细胞、巨核细胞等非造血细胞替代造血细胞。相比于对照组，骨髓组织中的ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＦＬＴ－３Ｌ蛋白水平明显增加。结果基本符合ＡＡ 标准。该方法操作简便不复杂，但长期腹腔注射，容易引起小鼠腹腔出血。 免疫介导方法 目前免疫介导的模型主要有２种方法：病毒感染和淋巴细胞输注。 病毒可以作为抗原激活 T 淋巴细胞增殖，并识别具有抗原表达的造血干细胞而发生自身免疫反应，导致骨髓衰竭; 也可能病毒直接破坏造血干细胞或同时感染骨髓基质细胞，破坏造血微环境而影响骨髓的造血功能。通过病毒感染制作再生障碍性贫血动物模型这方面所进行的研究较少，目前的报道有通过用巨细胞病毒和人类微小病毒 B19 持续感染小鼠，出现骨髓网状间充质细胞的缺失及骨髓功能损害。但同一病毒感染不同品系小鼠所介导的 AA 动物模型机制不同，此方法操作复杂，较难掌握。 目前免疫介导的 AA 动物模型大多通过淋巴细胞输注。BALB /c 小鼠作为受者，DBA /2 小鼠为淋巴细胞供者。无菌取DBA /2 小鼠胸腺及淋巴结，分别获得胸腺、淋巴结细胞悬液，活细胞 ＞ 95% ，胸腺细胞与淋巴结细胞以 1: 2 比例混合成为胸腺淋巴结细胞悬液。BALB /c 小鼠经 5 Gy 60Co-γ 射线全身照射(剂量率125． 35 cGy /min) ，照射后 20 小时内由尾静脉注入DBA /2 小鼠胸腺淋巴结细胞悬液。小鼠照射后立即移入 SPF级无菌层流室内，饮用加有庆大霉素( 40 万 U /L) 和二性霉素 B ( 50 mg /L) 高压灭菌水，观察并记录小鼠情况，28 天存活率 18.2%。此方法所制作的动物模型与人再障时表现相似。 物理化学方法 物理合并化学药物造模是目前比较新颖的造模方式，造模方法是将BALB/C小鼠先给予3.0Gy 137Cs γ射线照射（91cGy/min）约3min，2d后进行腹腔注射环磷酰胺25mg·kg-1·d-1、氯霉素 62.5mg·kg-1·d-1，共计3d。其造模结果显示，其WBC、RBC、PLT、Hb计数均较空白组显著下降，与空白组比较，第7天模型组的骨髓有核细胞数显著下降（P<0.05），骨髓病理切片抽检 显示各模型组骨髓中均有不同程度的造血细胞减少、脂肪细胞等非造血细胞增多。本模型造模时间短，操作简单，但存在辐射剂量和化学药物剂量较难以控制，以及模型血象后期是否 稳定仍需进一步实验研究进行完善。 模型评价标准 AA 动物模型判断标准: 外周血三系细胞减少、网织红细胞减少，骨髓活检示骨髓增生不良或低下、非造血细胞(脂肪细胞) 增多。临床上，再生障碍性贫血的血象降低首先是血小板减低。在再障诊断中，骨髓巨核细胞是一个非常重要的指标，如果患者骨髓中能见到较多的巨核细胞就可以直接除外再障。在再障血象恢复时血小板上升最慢，部分病人血色素和白细胞都正常了，但是血小板终身不恢复。因此建议在 AA 动物模型评判标准中增加对骨髓巨核细胞数减少的检测。 小结 获得性AA发病机制主要为骨髓造血干细胞异常、造 血 微 环 境 异 常、免 疫 异 常。采用物理、化学免疫等介导的方法，通过以上３种机制影响机体造血功能。其中，以淋巴细胞输注制作的获得性 ＡＡ 动物模型与人类 ＡＡ 最为相似，应用最为广泛。所以，此种方法制作的模型最具有研究前景。 综上，几种 ＡＡ 动物模型各有优缺点，但均存在 ＡＡ 期小鼠不稳定性，以及外周血三系下降不一致等问题，希望以后能在现有造模方法优点的基础之上，建立更加稳定、有效的模型制备方法。 |
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