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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » p了N多次测序结果要么是无结果，要么只能找到上游或下游引物，要么都找到，但非要片段
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fyn512045

新虫 (初入文坛)

[交流] p了N多次测序结果要么是无结果，要么只能找到上游或下游引物，要么都找到，但非要片段

请教各位了，我做了好长时间片段扩增了，每次的测序结果要么是无结果，要么只能找到上游或下游引物，要么都找到，但不是我要的片段，都做了好几个月了，一个很保守的区域，人家好几篇文章上能做出来，我一做也是前面那样，引物换了再换，我现在都不知道怎么办了？结题的时间快到了，我都快疯了！
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1楼 2009-09-12 11:31:05
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
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生命核心(金币+1,VIP+0):支持重新设计引物 9-12 23:25
P了N次都没有得到你想要的片段，说明你的引物设计有问题，很保守的区域一般都是很好扩的，我在我做的这个物种没有EST，只能靠兼并引物（CODEHOP在线设计），也摸了好长的时间，最后几个要的基因都拿到了片段，全长指日可待
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2楼2009-09-12 12:01:17
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anik

银虫 (正式写手)
退火温度呢？做个TOUCHDOWN-PCR
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3楼2009-09-12 14:15:31
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菊花茶

木虫 (著名写手)
★
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看一下是不是载体片段，如果是那目的片段就没连上
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4楼2009-09-12 14:41:22
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
★
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首先，确定一个你设计的引物有没有问题，如果引物没有问题，可以参考一下：
从基因组上P片段不会很容易，尤其是片断大于1kb,你可以把退火温度降到50度或者最低到45度试试，一定要确定P出的产物是你想要的目的大小的片段再拿去测序。
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5楼2009-09-12 15:18:33
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zhjwin

铁虫 (初入文坛)
★
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一般来说，遇到这种情况，引物的问题最大，特异性不强，建议重新设计引物
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6楼2009-09-12 18:47:35
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
★
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引物的方向没弄错吧？ 扩增的时候应该知道大概是多大的片段。只能找到上游或下游引物，这个有点诡异
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为梦想努力。
7楼2009-09-13 10:55:33
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
请问楼主是直接用pcr产物做的测序吗?做纯化了吗？
个人还是建议PCR产物做纯化连T去后，筛阳性单克隆去测序，这样至少不会出现无结果，或者双峰的情况。
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Thank-you，so-blue.
8楼2009-09-13 17:01:26
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fyn512045

新虫 (初入文坛)

谢谢各位了！

我每次的测序要的片段都扩增到了，检测条带也很亮，就是测序没有结果！不是PCR直接测序，做了克隆的。各种方法都试了，每次设计的兼并引物都做出想要的片段，都是克隆后测序就没有结果了。做了好几个月了，现在撑不住了！
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9楼2009-09-14 11:16:48
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菊花茶

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议你把你扩增片段的引物和菌液一块儿送去，测序用你的引物，不用载体引物。这样的好处要么测不出来，如果测出来那可定是你的片段。如果测不出，很可能是菌液质量不好，质粒产量过少。
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10楼2009-09-14 12:27:08
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