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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 大肠杆菌原核表达，菌液直接SDS-PAGE跑不出来条带，求助
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SuYuo

铁虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌原核表达，菌液直接SDS-PAGE跑不出来条带，求助 已有2人参与

最近在做原核表达，大肠杆菌诱导后做SDS-PAGE，其中菌液直接跑胶上个月还能做出来，突然有一天跑不出来了，怀疑是自己操作问题。
但是超声后的上清依然有目的蛋白表达，请问各位是什么原因？

我的样品处理是这样的：
1 取诱导后菌液，8000g5min离心，弃上清，PBS重悬再8000g5min离心，弃上清；
2 沉淀用25%原体积的裂解buffer重悬后，+蛋白上样buffer，95℃煮沸5min，12000g离心2min，取上清上样
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12
1楼 2022-08-17 20:02:39
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
知道问题了，蛋白表达量太低的原因，再次回复一下帮助避雷。
超声上清的很重的的条带是14kDa的溶菌酶， 因为刚好跟我的目的条带大小相近，导致我误认为是目的条带。
做了几个月也累积了一些经验，遇到困难的朋友可相互交流下。
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12
12楼2022-09-07 10:39:45
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
大肠杆菌原核表达，菌液直接SDS-PAGE跑不出来条带，求助

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12
2楼2022-08-17 20:05:06
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SuYuo

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by SuYuo at 2022-08-17 20:05:06

目的条带就是14kDa左右，很明显超声后的上清液有表达，但是菌液直接跑胶完全看不到

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12
3楼2022-08-17 20:06:40
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高飞雄

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SuYuo at 2022-08-17 20:06:40
目的条带就是14kDa左右，很明显超声后的上清液有表达，但是菌液直接跑胶完全看不到
...

你确认是不是把上清和诱导后的搞混了
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4楼2022-08-18 14:23:26
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