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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切完连接构建载体一直不成功
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切完连接构建载体一直不成功

切入DNA片段1385bp，载体4729bp

跑胶看亮度，片段大概10ng/ul，载体大概40ng/ul

片段加了15ul，载体2ul，buffer2ul，T4连接酶1ul，摩尔比大概1:6.5。

为什么一直连接不上呢？amp板上一个单克隆都没有

卡在这个实验已经一个月多了真的头秃了！

求帮助！

@youlinglyw @biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2022-08-07 11:09:42
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乌克兰跑男

铜虫 (正式写手)
这浓度够了，不加水连接，变一下比例。质粒上有其他抗性的话amp最后选

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我思故我在
2楼2022-08-07 14:16:39
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030Selma

金虫 (正式写手)
要不换无缝克隆？

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3楼2022-08-07 15:13:27
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 乌克兰跑男 at 2022-08-07 14:16:39
这浓度够了，不加水连接，变一下比例。质粒上有其他抗性的话amp最后选

昨天又做了两板，载体53.2ng/ul，片段15.7ng/ul，仪器测得浓度，OD260/280都有1.8。1:3比例做了10体系，1:7做了20体系，都没有长单克隆，我真的好迷茫啊，到底问题出在哪里了

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4楼2022-08-10 09:37:02
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 030Selma at 2022-08-07 15:13:27
要不换无缝克隆？

刚买了维诺赞的无缝克隆，我看了一下说明书，说同源臂最好40-60GC，但是我看我有一个酶切位点怎样最低都要62%，这样影响大吗？

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5楼2022-08-10 17:39:42
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Milkttttea

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Milkttttea at 2022-08-10 17:39:42
刚买了维诺赞的无缝克隆，我看了一下说明书，说同源臂最好40-60GC，但是我看我有一个酶切位点怎样最低都要62%，这样影响大吗？
...

而且GC有62%的话，同源臂就要有31bp这么长了（不包括酶切位点）

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6楼2022-08-10 20:54:54
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030Selma

金虫 (正式写手)
应该没问题，稍微加长5分钟反应时间试试

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7楼2022-08-16 23:30:13
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