24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 989  |  回复: 6
【悬赏金币】回答本帖问题,作者Milkttttea将赠送您 6 个金币

Milkttttea

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切完连接构建载体一直不成功

切入DNA片段1385bp,载体4729bp

跑胶看亮度,片段大概10ng/ul,载体大概40ng/ul

片段加了15ul,载体2ul,buffer2ul,T4连接酶1ul,摩尔比大概1:6.5。

为什么一直连接不上呢?amp板上一个单克隆都没有

卡在这个实验已经一个月多了真的头秃了!

求帮助!

@youlinglyw @biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan 发自小木虫IOS客户端
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

乌克兰跑男

铜虫 (正式写手)

这浓度够了,不加水连接,变一下比例。质粒上有其他抗性的话amp最后选

发自小木虫Android客户端
我思故我在
2楼2022-08-07 14:16:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

030Selma

金虫 (正式写手)

3楼2022-08-07 15:13:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Milkttttea

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 乌克兰跑男 at 2022-08-07 14:16:39
这浓度够了,不加水连接,变一下比例。质粒上有其他抗性的话amp最后选

昨天又做了两板,载体53.2ng/ul,片段15.7ng/ul,仪器测得浓度,OD260/280都有1.8。1:3比例做了10体系,1:7做了20体系,都没有长单克隆,我真的好迷茫啊,到底问题出在哪里了

发自小木虫IOS客户端
4楼2022-08-10 09:37:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Milkttttea

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 030Selma at 2022-08-07 15:13:27
要不换无缝克隆?

刚买了维诺赞的无缝克隆,我看了一下说明书,说同源臂最好40-60GC,但是我看我有一个酶切位点怎样最低都要62%,这样影响大吗?

发自小木虫IOS客户端
5楼2022-08-10 17:39:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Milkttttea

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Milkttttea at 2022-08-10 17:39:42
刚买了维诺赞的无缝克隆,我看了一下说明书,说同源臂最好40-60GC,但是我看我有一个酶切位点怎样最低都要62%,这样影响大吗?
...

而且GC有62%的话,同源臂就要有31bp这么长了(不包括酶切位点)

发自小木虫IOS客户端
6楼2022-08-10 20:54:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

030Selma

金虫 (正式写手)

应该没问题,稍微加长5分钟反应时间试试

发自小木虫Android客户端
7楼2022-08-16 23:30:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Milkttttea 的主题更新
不应助 确定回帖应助 (注意:应助才可能被奖励,但不允许灌水,必须填写15个字符以上)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿新疆大学085401,314分 +4 咔咔咔咔9 2026-04-05 4/200 2026-04-12 02:21 by 秋豆菜芽
[考研] 材料与化工300求调剂 +39 肖开文 2026-04-09 43/2150 2026-04-12 01:30 by 秋豆菜芽
[考研] 求调剂 +11 翩翩一书生 2026-04-09 11/550 2026-04-11 19:57 by 逆水乘风
[考研] 359求调剂 +5 胃痉挛累了 2026-04-11 5/250 2026-04-11 19:55 by lbsjt
[考研] 085501机械专硕 302分 不挑专业求调剂 +7 汪某. 2026-04-09 7/350 2026-04-11 14:37 by luhong1990
[考研] 086000调剂 +5 十七sa 2026-04-07 5/250 2026-04-11 10:38 by 紫曦紫棋
[考研] 298求调剂 +9 钉叮咚冬瓜 2026-04-07 11/550 2026-04-11 09:35 by zhq0425
[考研] 计算机类求调剂,22408-274分 +7 上岸de小虫 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:56 by fxue1114
[考研] 287求调剂 +15 Fnhc 2026-04-07 21/1050 2026-04-10 19:09 by chemisry
[考研] 085404 298分求调剂 +10 呼啦呼啦呼呼呼 2026-04-10 11/550 2026-04-10 16:44 by wangy0907
[考研] 298求调剂 +13 钉叮咚冬瓜 2026-04-09 13/650 2026-04-10 15:49 by jiajinhpu
[考研] 278求调剂 +27 范婷娜 2026-04-07 31/1550 2026-04-09 20:49 by zhouxiaoyu
[考研] 考研调剂 +13 冰冰,,, 2026-04-07 13/650 2026-04-09 17:01 by Lilly_Li
[考研] 085600材料与化工专硕329 求调剂 +24 额cc 2026-04-06 25/1250 2026-04-09 16:01 by wp06
[考研] 一志愿鲁东大学071000生物学学硕初试分数276求调剂 +3 慕绝cc 2026-04-09 3/150 2026-04-09 09:57 by liuhuiying09
[考研] 293分求调剂,外语为俄语 +7 加一一九 2026-04-07 10/500 2026-04-08 20:14 by yutian743
[考研] 388求调剂 +6 四川王涛 2026-04-07 8/400 2026-04-08 00:17 by JourneyLucky
[考研] 材料工程专业日语生求调剂 +9 111623 2026-04-07 9/450 2026-04-07 23:31 by 一只好果子?
[考研] 327考研调剂推荐 +6 呜呜呜呜呢 2026-04-06 6/300 2026-04-06 21:39 by 啵啵啵0119
[考研] 085500机械专硕初试288求调剂 +3 GZJguo666- 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:06 by jkddd
信息提示
请填处理意见