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动物实验日常操作系列：乳鼠心肌细胞分离
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实验步骤： 1.乳鼠心肌细胞比成年心肌细胞容易培养，而且对缺血缺氧的耐受性好。 2.抓住小鼠后颈肩胛骨处，使胸腔向前。 3.用无名指和小指固定小鼠后肢。 4.将小鼠放入75%酒精中消毒。下面放一个纱布，吸取掉落酒精。 5.从小鼠左肋缘锁骨中线处入剪刀，剪至锁骨中线，注意剪刀上翘，如果心脏未暴露，可以自剪线的中点剪向胸骨。 6.剪取心尖部心肌，放在DMEM中。 7.用小镊子轻轻挤压心尖部，注意不要用力过度，避免镊子碰撞。 8.换液，清洗二次。 9.在培养皿中将组织剪碎。 10.将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加配好的胰酶和胶原酶，37°℃消化5 min至8分钟，自然沉淀，弃上清，再加入胰酶和胶原酶，重复操作，吸取上清，反复操作6至8次，二次完成时加入血清，终止胰酶对细胞的损害。 11.操作完成后用滤器除去其中的纤维和胶原等。 12.离心换液，除去胶原酶，(胶原酶是外来物质，对细胞有损伤)将培养瓶放在37°C孵箱中1~2个小时，使成纤维细胞贴壁，而心肌细胞贴壁多需要6~8小时，分离作用。 13原理:心肌细胞本来就是不容易贴壁的细胞，在除去心肌细胞中混杂的成纤维细胞和内皮细胞就是利用成纤维细胞和内皮细胞贴壁快而心肌细胞贴壁慢的原理进行换皿法来纯化心肌细胞的。换皿后最好48小时内对你所培养的心肌细胞不进行任何处理，包括观察，这样应该没有问题了。如果还是不能够贴壁的话，你可以考虑一下用塑料瓶，或者对培养用的玻璃瓶进行如下处理：在培养前进行鼠尾胶原包被或者硝酸蚀刻或者纤粘连蛋白包被，这方面可以参考文献。 14.吸取培养液中的心肌细胞，将成纤维细胞保存待用，心肌细胞中加入5—溴尿喀啶（终止RNA的合成)，终止其中的成纤维细胞的分裂，并做计数。 将心肌细胞培养十二小时，一定不要动,放在孵箱的最里面 15.将心肌细胞冻存、传代。 |
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