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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建载体连接体系问题
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sgmmupup

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建载体连接体系问题 已有2人参与

我想问问关于构建载体时连接体系的问题，我的目的片段（1076bp）要连到载体（5900bp）上，测出片段浓度（17.5ng/ul）、载体浓度（9.71ng/ul)，连接酶用的是solutionI，如果要摩尔比1：3的话，在10ul体系里要加多少ul载体和片段DNA呢？做过两三次转化都没长菌

@biostar2009 @biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2022-05-24 08:59:53
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你载体和片段的浓度都有一些低，而且你的载体和片段长度不大，回收比例应该比这个高，针对你目前的问题，我的建议如下：
1)扩大连接体系，如将20微升做到40微升，转大肠杆菌，可以同时转两支；
2）重新酶切回收你的片段，让浓度提高后，再做。
PS：连接体系是否按照1:3的比例，是经验值，而且取决于你片段与载体的大小，没必要过度纠结。
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不是优秀，而是不可替代
2楼2022-05-24 15:36:43
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霸_霸

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测的dna浓度不准，不如看跑胶的亮度，与maker做对比，从而决定加入的量，你这是不长斑，估计大概率问题出现在大载上，是胶回收的吗？扩大体系重新切吧
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3楼2022-05-25 09:47:37
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