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labinnah金虫 (正式写手)
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AKK菌粉复苏培养 已有2人参与
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第一次做菌种复苏，还是厌氧菌，完全小白一个。 买的CICC的akk菌（相较于ATCC的便宜），按说明书要求配制了巧克力血平板，同时也按照部分文献参数配制了含L-苏氨酸及N-乙酰-D-氨基葡萄糖的改良BHI液体培养基。将菌粉用无菌生理盐水溶解后，各板/管加入50或100 uL菌液，平板涂布、试管混匀后分两批，分别放入37℃厌氧产气袋或厌氧培养箱中，到现在48h，只有一管BHI液体明显浑浊，还有飘絮一样的物质。其余未见菌生长  想请教大家： 1.菌粉冻干管之前一直按说明书要求4℃保存，但距现在使用时已有3个多月，菌是否可能已死亡？ 2.说明书提示要用巧克力平板复苏，按配方溶解琼脂灭菌后，80-90℃加入无菌脱纤维羊血，继续酒精灯上摇匀5min左右，但发现琼脂内部还是存在细微的血凝块样物质（直径≤1mm），不像有些巧克力血平板那样质地均匀，这个巧克力血平板是不是做翻车了？做了2批都是这样 3.目前巧克力血平板表面未见菌落，但不知道有没有菌膜生成，背景色太深看不清楚。操作时加的50或100uL菌是不是太多了？导致没有单个菌落生成 4.说明书对时间说明有点笼统，只提到“菌种常规培养时间：细菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌 7-10天”，并未细化。看到文献提到用BHI培养基复苏三至七天的都有，我目前培养时间48h是不是短了，得继续等等看？但是万一等到7天都没有是不是就实锤翻车了？ 5.唯一的BHI浑浊飘絮可能是污染吗？ 先谢过各路大佬了，求大佬翻牌，谢谢  |
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【答案】应助回帖
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labinnah: 金币+200, ★★★★★最佳答案 2022-04-15 22:39:30
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买的CICC的akk菌（相较于ATCC的便宜），按说明书要求配制了巧克力血平板，同时也按照部分文献参数配制了含L-苏氨酸及N-乙酰-D-氨基葡萄糖的改良BHI液体培养基。 /CICC的菌种还是比较靠谱的，培养基推荐用 硫乙醇酸盐流体培养基(FT)，试剂商有成品销售。刚开始不建议养这么难养的厌氧菌，先用金葡或者大肠练练手。 将菌粉用无菌生理盐水溶解后，各板/管加入50或100 uL菌液，平板涂布、试管混匀后分两批，分别放入37℃厌氧产气袋或厌氧培养箱中，到现在48h， /AKK是严苛厌氧菌，所有接触的水溶液最好都做驱氧处理，溶解氧会杀死菌株 只有一管BHI液体明显浑浊，还有飘絮一样的物质。其余未见菌生长 /是否污染需要检测，从培养时间上看不会是真菌污染，可以取部分菌液出来，反正非厌氧环境中观察菌是否会继续增殖或者死亡。 想请教大家： 1.菌粉冻干管之前一直按说明书要求4℃保存，但距现在使用时已有3个多月，菌是否可能已死亡？ /冻干粉状态可以保存很久，十年八年死不了。 2.说明书提示要用巧克力平板复苏，按配方溶解琼脂灭菌后，80-90℃加入无菌脱纤维羊血，继续酒精灯上摇匀5min左右，但发现琼脂内部还是存在细微的血凝块样物质（直径≤1mm），不像有些巧克力血平板那样质地均匀，这个巧克力血平板是不是做翻车了？做了2批都是这样 /血平板可以找试剂商购买成品的，便宜还质量可靠，比自己做划算 3.目前巧克力血平板表面未见菌落，但不知道有没有菌膜生成，背景色太深看不清楚。操作时加的50或100uL菌是不是太多了？导致没有单个菌落生成 /涂布的话很难有单菌落生成，如果为了纯化，请划线来获得单菌落。 4.说明书对时间说明有点笼统，只提到“菌种常规培养时间：细菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌 7-10天”，并未细化。看到文献提到用BHI培养基复苏三至七天的都有，我目前培养时间48h是不是短了，得继续等等看？但是万一等到7天都没有是不是就实锤翻车了？ /AKK是细菌，正常48小时就长好了，除非生长条件不合适。可以再等等 5.唯一的BHI浑浊飘絮可能是污染吗？ /是否污染需要检测，从培养时间上看不会是真菌污染，可以取部分菌液出来，反正非厌氧环境中观察菌是否会继续增殖或者死亡。 |
labinnah4楼2022-04-15 14:57:58
2楼2022-04-15 14:22:08
【答案】应助回帖
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做下镜检对比一下，菌株形态，或者送检16s测序 https://www.jcm.riken.jp/cgi-bin ... amp;CN=&DN= |
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3楼2022-04-15 14:28:58
labinnah
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