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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » AKK菌粉复苏培养
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labinnah

金虫 (正式写手)

[求助] AKK菌粉复苏培养 已有2人参与

第一次做菌种复苏，还是厌氧菌，完全小白一个。

买的CICC的akk菌（相较于ATCC的便宜），按说明书要求配制了巧克力血平板，同时也按照部分文献参数配制了含L-苏氨酸及N-乙酰-D-氨基葡萄糖的改良BHI液体培养基。将菌粉用无菌生理盐水溶解后，各板/管加入50或100 uL菌液，平板涂布、试管混匀后分两批，分别放入37℃厌氧产气袋或厌氧培养箱中，到现在48h，只有一管BHI液体明显浑浊，还有飘絮一样的物质。其余未见菌生长

想请教大家：
1.菌粉冻干管之前一直按说明书要求4℃保存，但距现在使用时已有3个多月，菌是否可能已死亡？
2.说明书提示要用巧克力平板复苏，按配方溶解琼脂灭菌后，80-90℃加入无菌脱纤维羊血，继续酒精灯上摇匀5min左右，但发现琼脂内部还是存在细微的血凝块样物质（直径≤1mm），不像有些巧克力血平板那样质地均匀，这个巧克力血平板是不是做翻车了？做了2批都是这样
3.目前巧克力血平板表面未见菌落，但不知道有没有菌膜生成，背景色太深看不清楚。操作时加的50或100uL菌是不是太多了？导致没有单个菌落生成
4.说明书对时间说明有点笼统，只提到“菌种常规培养时间：细菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌 7-10天”，并未细化。看到文献提到用BHI培养基复苏三至七天的都有，我目前培养时间48h是不是短了，得继续等等看？但是万一等到7天都没有是不是就实锤翻车了？
5.唯一的BHI浑浊飘絮可能是污染吗？

先谢过各路大佬了，求大佬翻牌，谢谢
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1楼 2022-04-15 12:47:59
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testobio

银虫 (小有名气)
我们用的 硫乙醇酸盐液体培养基  37°  厌氧

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labinnah
泰斯拓生物www.testobio.com提供atcc，dsm，ccug等国外保藏中心菌株购买，联系电话15658058000
2楼2022-04-15 14:22:08
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testobio

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做下镜检对比一下，菌株形态，或者送检16s测序

https://www.jcm.riken.jp/cgi-bin ... amp;CN=&DN=
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labinnah
泰斯拓生物www.testobio.com提供atcc，dsm，ccug等国外保藏中心菌株购买，联系电话15658058000
3楼2022-04-15 14:28:58
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明舟生物

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
labinnah: 金币+200, ★★★★★最佳答案 2022-04-15 22:39:30
买的CICC的akk菌（相较于ATCC的便宜），按说明书要求配制了巧克力血平板，同时也按照部分文献参数配制了含L-苏氨酸及N-乙酰-D-氨基葡萄糖的改良BHI液体培养基。
/CICC的菌种还是比较靠谱的，培养基推荐用         硫乙醇酸盐流体培养基(FT)，试剂商有成品销售。刚开始不建议养这么难养的厌氧菌，先用金葡或者大肠练练手。

将菌粉用无菌生理盐水溶解后，各板/管加入50或100 uL菌液，平板涂布、试管混匀后分两批，分别放入37℃厌氧产气袋或厌氧培养箱中，到现在48h，
/AKK是严苛厌氧菌，所有接触的水溶液最好都做驱氧处理，溶解氧会杀死菌株

只有一管BHI液体明显浑浊，还有飘絮一样的物质。其余未见菌生长
/是否污染需要检测，从培养时间上看不会是真菌污染，可以取部分菌液出来，反正非厌氧环境中观察菌是否会继续增殖或者死亡。

想请教大家：
1.菌粉冻干管之前一直按说明书要求4℃保存，但距现在使用时已有3个多月，菌是否可能已死亡？
/冻干粉状态可以保存很久，十年八年死不了。

2.说明书提示要用巧克力平板复苏，按配方溶解琼脂灭菌后，80-90℃加入无菌脱纤维羊血，继续酒精灯上摇匀5min左右，但发现琼脂内部还是存在细微的血凝块样物质（直径≤1mm），不像有些巧克力血平板那样质地均匀，这个巧克力血平板是不是做翻车了？做了2批都是这样
/血平板可以找试剂商购买成品的，便宜还质量可靠，比自己做划算

3.目前巧克力血平板表面未见菌落，但不知道有没有菌膜生成，背景色太深看不清楚。操作时加的50或100uL菌是不是太多了？导致没有单个菌落生成
/涂布的话很难有单菌落生成，如果为了纯化，请划线来获得单菌落。

4.说明书对时间说明有点笼统，只提到“菌种常规培养时间：细菌1-2天，酵母3天，霉菌5-7天，大型真菌 7-10天”，并未细化。看到文献提到用BHI培养基复苏三至七天的都有，我目前培养时间48h是不是短了，得继续等等看？但是万一等到7天都没有是不是就实锤翻车了？
/AKK是细菌，正常48小时就长好了，除非生长条件不合适。可以再等等

5.唯一的BHI浑浊飘絮可能是污染吗？
/是否污染需要检测，从培养时间上看不会是真菌污染，可以取部分菌液出来，反正非厌氧环境中观察菌是否会继续增殖或者死亡。
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labinnah
4楼2022-04-15 14:57:58
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labinnah

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2楼: Originally posted by testobio at 2022-04-15 14:22:08
我们用的 硫乙醇酸盐液体培养基  37°  厌氧

谢谢，我买点试试看，浓度一般配多少呢？
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5楼2022-04-15 22:35:01
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labinnah

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3楼: Originally posted by testobio at 2022-04-15 14:28:58
做下镜检对比一下，菌株形态，或者送检16s测序

https://www.jcm.riken.jp/cgi-bin/jcm/jcm_keyword?AN=Akkermansia&BN=muciniphila&CN=&DN=

谢谢，明早72h时拿出来传代试试，顺便染个色看看
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6楼2022-04-15 22:41:01
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labinnah

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 明舟生物 at 2022-04-15 14:57:58
买的CICC的akk菌（相较于ATCC的便宜），按说明书要求配制了巧克力血平板，同时也按照部分文献参数配制了含L-苏氨酸及N-乙酰-D-氨基葡萄糖的改良BHI液体培养基。
/CICC的菌种还是比较靠谱的，培养基推荐用         硫乙醇酸 ...

多谢大佬，还有个疑问请教一下，to Answer #4：/AKK是细菌，正常48小时就长好了，除非生长条件不合适。可以再等等。

假如细菌48h长好了，我7d后才打开，留给我的是不是只有尸体了？
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7楼2022-04-15 22:59:49
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明舟生物

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by labinnah at 2022-04-15 22:59:49
多谢大佬，还有个疑问请教一下，to Answer #4：/AKK是细菌，正常48小时就长好了，除非生长条件不合适。可以再等等。

假如细菌48h长好了，我7d后才打开，留给我的是不是只有尸体了？...

不会的，细菌在营养不够生长的时候会进入半休眠状态，不再增殖，停止生长，但是不会那么容易死亡，除非特殊的菌，比如 肺炎链球菌 ，这个菌不能培养超过24小时，超过就开始自杀。。。。
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labinnah
8楼2022-04-18 09:27:51
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labinnah

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by 明舟生物 at 2022-04-18 09:27:51
不会的，细菌在营养不够生长的时候会进入半休眠状态，不再增殖，停止生长，但是不会那么容易死亡，除非特殊的菌，比如 肺炎链球菌 ，这个菌不能培养超过24小时，超过就开始自杀。。。。...

多谢多谢
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9楼2022-04-18 12:56:18
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