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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大肠杆菌电转遇到的问题
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)

[交流] 大肠杆菌电转遇到的问题

我是用重组系统进行大肠杆菌的基因敲除，用的辅助性质粒是PKD46和PCP20，基因已经成功的敲除了，为了消除抗生素抗性，需要电转PCP20，但电转了4，5次了，都没成功，真的郁闷死了，以前电转PKD46和重组片段时也没这么波折，不知道PCP20是不是有什么特殊的电转条件？感受态都是新制备的，菌浓不是太高，50 ml的菌液离心后，用水洗了两次，10%甘油洗一次，10%甘油 500 ul 溶解后分装。电转时50 ul感受态加了不同浓度的质粒，5，6，7，8，9，10 ul。质粒也是一星期之内提取的，跑电泳后发现条带不是很亮。电转条件是2.5 KV，2 mm的电转杯。 不知道问题是出在哪里了？
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为梦想努力。
1楼 2009-09-06 21:24:12
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
今天发现菌长出来了，还没验证，不过应该没大问题，涂了4个板，每个板都长了很多，总结了一下，可能的原因有两点：1） 感受态制备的时候，菌体不一定是生长到OD 0.4左右，我以前做的菌体浓度都很高OD应该在1以上，每次电转都很成功，就最近这几次是完全按照说明来做的，菌体浓度明显偏低（这个可以在最后加甘油溶解的时候少加些，浓度也可以提上去，不低于10的10次方就可以了），2）抗性平板时只加了一种含质粒抗性的那种抗生素，菌体本身带有的抗性抗生素没有加。第一个原因可能不具有普遍性，也是针对不同的菌有不同的要求。
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为梦想努力。
10楼2009-09-08 17:09:53
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liluolove

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看上去应该是没有什么问题的。
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2楼2009-09-06 21:56:07
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
弱弱问下,你制感受态没用氯化钙洗吗？
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Thank-you，so-blue.
3楼2009-09-07 08:48:18
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kitty8682

金虫 (正式写手)
质粒需要线性化吗
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4楼2009-09-07 08:57:41
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rosalie161

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不太清楚，不过我也马上就要做基因敲除了，可以借鉴一下楼主的答案！
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Rosalei.....
5楼2009-09-07 09:00:18
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 9/7/09  08:48:
弱弱问下,你制感受态没用氯化钙洗吗？

电转的感受态不用的
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为梦想努力。
6楼2009-09-07 14:42:26
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by kitty8682 at 9/7/09  08:57:
质粒需要线性化吗

质粒不需要线性话啊，我只是之前我电转过一个PCR的片段
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为梦想努力。
7楼2009-09-07 14:43:12
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beibei3372

金虫 (初入文坛)

电转vs化转

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的质粒有多大？有时候质粒的大小与转化方法的选择也是有一定的联系的。
我原来重组质粒用电转就是转不进去，改用化转后就好了！
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8楼2009-09-07 16:50:40
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zhouzhou_3006

木虫 (著名写手)
PCP20这个是基因敲除经常用到的质粒，身边的人用电转方法做的，据说转化率都很高的，我用的方法和他们也是一样的，就是含PCP20这个质粒的菌是07年保藏的，现在重新培养菌，提质粒用应该不成问题吧？感觉就是质粒除了问题，因为每次感受态都是现做的，已经重复5-6次了。质粒提过两次。
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为梦想努力。
9楼2009-09-08 10:37:41
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