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xiangao

金虫 (正式写手)

[交流] 酶切难题

最近构建的重组载体5200左右,先用BamHI切如图,最亮带大小在5000-6000之间,应该是构建成功,而后用SalI切想回收目的片段,目的片段和质粒大小都2600左右,理论上应该在2600左右出现一条带,可是我切完之后怎么在4000左右出现了一条带且只有这一条带(无图)。
另外我把重组载体用BamHI和SalI同时双酶切,如2图所示,也应该是2600左右两条带(重合),怎么图是那样子?(2图marker中最亮带3000,上面4000,下面2500)
请高手帮忙,不胜感激!

[ Last edited by xiangao on 2009-9-6 at 21:32 ]
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xiangao

金虫 (正式写手)

上面只是克隆了一段目的基因,双酶切后还要连到表达载体上,这可怎么连啊?都切不对
4楼2009-09-06 21:48:26
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xiangao

金虫 (正式写手)

不知道问题出在哪?双酶切那图最亮带4000左右了,下面那条难道是目的带(2600左右)?怎么会出现三条带?没切开吗?还是本来载体构建出了问题?
从第一张图单酶切看,好像载体大小5000-6000之间,大小是对的啊!
3楼2009-09-06 21:46:27
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银杏下

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果我没猜错的话应该是在你的目的基因上有BamHI酶切位点,而且这个酶切位点应该是在目的基因的中间1000-1500之间,图1中很明显说明不只一个BamHI酶切位点,图2则说明在酶切不完全的情况下,一部分被切开,另一部分没有切开,仍然较大。当然这只是我的猜测,我建议你降低质粒浓度(依图中看至少要降3倍)再酶切看看,因为你这图酶切质粒浓度太高,酶切不完全,所以很难断定。
6楼2009-09-06 23:03:19
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xiangao

金虫 (正式写手)

谢谢!不过就一个BamHI酶切位点,是我设计引物时加上的(另外还加了个SalI)目的想把它切下来。切下来之后两个片段都2600左右,可现在图上切的大小都不对,而且有杂带。
7楼2009-09-07 08:21:26
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