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叔扬

新虫 (初入文坛)

[交流] 以已有的PCR产物做模板进行PCR

我原来做克隆的时候扩增得到过一批PCR产物。现在因为要更换PCR产物两端的酶切位点,就采取如下策略:以原来的PCR产物作为模板,用具备新酶切位点的引物扩增,以获得具备新酶切位点的PCR产物。

我把之前扩增得到的PCR产物(-20度冻存)稀释100倍,作为模板进行扩增。然而,电泳结果显示有的PCR产物目的条带不足够明显,而且有很长的smere拖带。
各位对此有何见解呢?
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小子无识
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你这个感觉像是做nested PCR,这个有的时候要用到高保真酶,然后引物浓度或退火温度不合适也可能引起非特异性扩增~
3楼2009-09-04 17:17:24
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银杏下

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
为什么不用原先初始模板(一般是质粒或基因组)为模板呢?利用PCR产物为模板会增加突变率,因为这个过程突变的片段比例被扩大,所以不太建议。
2楼2009-09-04 17:05:42
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叔扬

新虫 (初入文坛)

的确,用初始的基因组总DNA做模板最好。然而,有时候实验有各种因素的影响,比如说基因组总DNA暂时不在手头,而原来的PCR产物正好在旁边等等。

总之,谢谢各位探讨。我把PCR体系的Mg2+的浓度降低,然后把褪火温度提高了1度。结果表明,目的条带很浓,而杂带明显减少了。
小子无识
4楼2009-09-07 13:48:13
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