24小时热门版块排行榜    

查看: 773  |  回复: 3
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

叔扬

新虫 (初入文坛)

[交流] 以已有的PCR产物做模板进行PCR

我原来做克隆的时候扩增得到过一批PCR产物。现在因为要更换PCR产物两端的酶切位点,就采取如下策略:以原来的PCR产物作为模板,用具备新酶切位点的引物扩增,以获得具备新酶切位点的PCR产物。

我把之前扩增得到的PCR产物(-20度冻存)稀释100倍,作为模板进行扩增。然而,电泳结果显示有的PCR产物目的条带不足够明显,而且有很长的smere拖带。
各位对此有何见解呢?
回复此楼
小子无识
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

holyala

木虫 (著名写手)

砖家


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你这个感觉像是做nested PCR,这个有的时候要用到高保真酶,然后引物浓度或退火温度不合适也可能引起非特异性扩增~
3楼2009-09-04 17:17:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 4 个回答

银杏下

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
为什么不用原先初始模板(一般是质粒或基因组)为模板呢?利用PCR产物为模板会增加突变率,因为这个过程突变的片段比例被扩大,所以不太建议。
2楼2009-09-04 17:05:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

叔扬

新虫 (初入文坛)

的确,用初始的基因组总DNA做模板最好。然而,有时候实验有各种因素的影响,比如说基因组总DNA暂时不在手头,而原来的PCR产物正好在旁边等等。

总之,谢谢各位探讨。我把PCR体系的Mg2+的浓度降低,然后把褪火温度提高了1度。结果表明,目的条带很浓,而杂带明显减少了。
小子无识
4楼2009-09-07 13:48:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 7lpolszZVXgi 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:41 by 4wMiSEwB6436
[考研] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 7lpolszZVXgi 2026-08-14 6/300 2026-08-15 04:21 by 4wMiSEwB6436
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 4/200 2026-08-15 04:17 by 4wMiSEwB6436
[找工作] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 4/200 2026-08-15 02:21 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +11 Tide man 2026-08-10 12/600 2026-08-15 02:12 by home3163
[硕博家园] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 4/200 2026-08-15 01:28 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[论文投稿] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-15 00:16 by 4wMiSEwB6436
[教师之家] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-14 22:32 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +23 医学老男孩 2026-08-13 49/2450 2026-08-14 20:02 by zhaifei
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[论文投稿] 职称评审,求友友推荐见刊最快的期刊 +5 工厂打螺丝 2026-08-08 5/250 2026-08-14 11:03 by 玖戈弋
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode,很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
信息提示
请填处理意见