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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 以已有的PCR产物做模板进行PCR
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叔扬

新虫 (初入文坛)

[交流] 以已有的PCR产物做模板进行PCR

我原来做克隆的时候扩增得到过一批PCR产物。现在因为要更换PCR产物两端的酶切位点，就采取如下策略：以原来的PCR产物作为模板，用具备新酶切位点的引物扩增，以获得具备新酶切位点的PCR产物。

我把之前扩增得到的PCR产物（-20度冻存）稀释100倍，作为模板进行扩增。然而，电泳结果显示有的PCR产物目的条带不足够明显，而且有很长的smere拖带。
各位对此有何见解呢？
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小子无识
1楼 2009-09-04 17:00:20
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银杏下

金虫 (小有名气)
★
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为什么不用原先初始模板（一般是质粒或基因组）为模板呢？利用PCR产物为模板会增加突变率，因为这个过程突变的片段比例被扩大，所以不太建议。
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2楼2009-09-04 17:05:42
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你这个感觉像是做nested PCR，这个有的时候要用到高保真酶，然后引物浓度或退火温度不合适也可能引起非特异性扩增~
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3楼2009-09-04 17:17:24
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叔扬

新虫 (初入文坛)
的确，用初始的基因组总DNA做模板最好。然而，有时候实验有各种因素的影响，比如说基因组总DNA暂时不在手头，而原来的PCR产物正好在旁边等等。

总之，谢谢各位探讨。我把PCR体系的Mg2+的浓度降低，然后把褪火温度提高了1度。结果表明，目的条带很浓，而杂带明显减少了。
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小子无识
4楼2009-09-07 13:48:13
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