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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助克隆基因扩增问题
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 求助克隆基因扩增问题

克隆基因时2600bp的片段用Taq扩很亮，用高保真酶Kod，pfu均没扩出来，反应体系按推荐的和别人扩出来过的体系，两种酶均作过退火温度梯度试验，可是都没有带。大家有遇到过这种情况么？怎么解决的呢？谢谢，谢谢
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
1楼 2009-09-03 18:28:55
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
能不能再提供点信息，比如，引物TM值，克隆用的载体，用TAQ有没有重扩试下等
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2楼2009-09-03 19:03:54
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wangxiaoli8216

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
或许楼主可以考虑Taq与PFU混合使用
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3楼2009-09-03 20:21:39
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
pfu酶活要比taq差，pcr反应体系和循环体系要重新摸索。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-09-03 21:45:53
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用pfu扩增的时候延伸的时间要长不少，因为它的扩增效率是taq的1/2。假如taq能

1min扩增1000bp的话，pfu就只有500bp了。所以你的2600bp要是延伸时间设置的

2min或者以下的话，效果可想而知。

建议使用taq与pfu的混合酶扩增，或者extaq也可以。

祝好运。这步不应该费劲的。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2009-09-03 22:23:59
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695

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-9-3 22:23:
用pfu扩增的时候延伸的时间要长不少，因为它的扩增效率是taq的1/2。假如taq能

1min扩增1000bp的话，pfu就只有500bp了。所以你的2600bp要是延伸时间设置的

2min或者以下的话，效果可想而知。

建议使用taq ...

学习了
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6楼2009-09-03 22:41:37
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kitty8682

金虫 (正式写手)
pfu应该比Taq好一些吧
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7楼2009-09-04 09:32:13
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十比

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用扩增效率更高的高保真酶应该可心吧。
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8楼2009-09-04 11:55:04
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love_st

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
pfu酶因为有3-5的外切酶作用所以扩增能力要比taq差对于2k多的片段，你还是要优化下条件的
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9楼2009-09-04 15:36:17
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小瞥

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
pfu的扩增效率不如rTaq, 但是用rTaq扩了应该就可以了
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10楼2009-09-04 16:02:16
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