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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母pGAPZαA转化染菌问题
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云之遥V

新虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母pGAPZαA转化染菌问题 已有1人参与

求助毕赤酵母转化过程中的问题，使用的是pGAPZαA质粒，Zeocin浓度100ug/ml，感受态使用山梨醇处理制备而成，现做现用，转化后对照平板总是长菌，不知道原因，师姐就没遇到过类似问题，本人怀疑可能有以下几个可能原因：
1.抗生素浓度不够，但师姐同样的质粒50ug/ml都没出现过这种问题！！！
2.电转时加菌液过多，自己加了200ul，文献都是100ul，导致 转化效率不够，但为什么会长菌呢？
3.离心涂布时留菌液太多，留100ul和200ul，我都试过，100ul涂布比较干，200ul比较湿润，难道这也影响？
4.100ml菌液，od1.3左右，感受态制备4，5管，难道说菌太多抗生素无法抑制？之前做过分装10管的话对照不会长菌，但会不会影响转化效率，而且别人正常分装4,5管也没事呀，哭了。。。
求助大神帮忙解决，很平常的转化一直困扰我很久了。
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1楼 2022-03-13 11:36:40
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澜沧的爱

新虫 (小有名气)
一些建议： 1.转化用菌株验证一下，是不是染菌了，自带了zeocin抗性  2. 电转杯污染，重新处理电转杯，重新转化。(电转过程，比如菌液分装量，涂布之类的，对实验结果一般不会有太大的影响的)    祝好！

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2楼2022-03-16 11:00:14
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zhz0809

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

阴性对照长菌，只有2个可能：1平板抗性失效；2你的酵母感受态菌株有问题；建议做完酵母感受态后，直接把你的感受态在zeocin平板上观察；如果直涂都长菌，就是平板或者菌株有问题，对照下，看看是哪里的问题。
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3楼2022-03-23 22:50:24
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