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救救孩子，PCR做了半年了没结果 已有7人参与
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我首先提取螨虫体的基因组DNA，特异性扩增螨虫基因组中一段稳定遗传且保守的序列ITS2，扩增之后送PCR产物测序，然后比对测序结果得到相似度（大于90%），以这种方法来检定虫种的纯度。 我有400个虫体样本需要检定，每次检定到100多个虫种时，扩增的条带会出现引物二聚体，然后引物二聚体越来越严重，最后目的条带消失，出现涂抹带现象。本来认为是引物降解的原因，我合成了新的引物，也没有用。提取DNA我们使用的是索莱宝的动物基因组提取试剂盒，由于螨虫极小，所以提取的浓度只有不到3ng/μl，尝试了其他的提取方式但是都没有解决。但是在实验的前100虫体都很顺利，之后条带就逐渐消失。最后我直接重新设计了引物，扩增出来的条带及其明亮单一，用以前做不出来的DNA作为模板也是单一明亮的条带。由于重新设计了引物所以400个样本的检定又要重新开始，奇怪的地方又出现了，检定了一部分时之后又出现了同样的问题。之后我又设计了第三对引物，检定了一部分时之后同样的问题又出现了。 总之只要我重新设计引物扩增条带就很好，但是使用一段时间后就不稳定了。就算重新合成新的引物也是如此，除非重新设计新序列的引物。   发自小木虫Android客户端 |
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4楼2022-02-23 18:28:10
shuaibia6
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5楼2022-02-23 21:42:12
6楼2022-02-23 21:43:40
送红花一朵 |
这个想法我前几天也突然想到过，是不是因为我的大量pcr造成了某些污染？这些污染飘散在空中特异性的结合我的引物结合造成特异性的引物污染，只要我合成新序列的引物这种特异性的结合就会消失。因为是新的序列，这种积累还不是很强烈，所以条带又会突然的变亮。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2022-02-23 21:46:21
shuaibia6
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5