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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 请教2-oxoglutarate-dependent dioxygenases体外酶活检测注意事项
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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)

[求助] 请教2-oxoglutarate-dependent dioxygenases体外酶活检测注意事项 已有2人参与

最近在做一个2-oxoglutarate-dependent dioxygenases的体外酶活活性一直做不出来，于是找了一个文章报道的已知功能的酶去做体外酶活，蛋白纯化没问题，体外酶活条件也是按照文献报道做的，可是也做不出来，求助大神这个反应有没有什么需要注意的细节没。
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1楼 2022-01-15 22:31:01
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by Dylan苏木樨 at 2022-01-18 12:32:00
酶是大肠杆菌诱导纯化出来的。这个酶反应需要Fe(2+)，也已经在酶活体系中添加，底物是水杨酸。使用液相同时检测底物减少和产物生成都没有什么变化...

如果我做的话，会从以下几个条入手
（1）先确认纯化出来的蛋白是否含有Fe
（2）确认蛋白中Fe是 2价，还是3价
如果纯化不注意，蛋白含有Fe(III) (蛋白浓一点，明显泛黄），即使加入Fe(II)不会改善蛋白活性，可以加入DTT看是否有改善
含Fe(II)蛋白，浓的话，会泛青绿色
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行至水穷处，坐看云起时
8楼2022-03-15 21:16:59
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶是怎么纯化出来的？ 大肠杆菌重组表达？该酶是否含有Fe(2+), 底物是什么，活性检测是检测底物减少，还是产物增加？
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2022-01-16 12:16:27
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Dylan苏木樨

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2022-01-16 12:16:27
酶是怎么纯化出来的？ 大肠杆菌重组表达？该酶是否含有Fe(2+), 底物是什么，活性检测是检测底物减少，还是产物增加？

酶是大肠杆菌诱导纯化出来的。这个酶反应需要Fe(2+)，也已经在酶活体系中添加，底物是水杨酸。使用液相同时检测底物减少和产物生成都没有什么变化
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3楼2022-01-18 12:32:00
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凯凯冲冲冲

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by Dylan苏木樨 at 2022-02-22 13:54:59
自己顶一下

体外酶活需要注意 温度 想请教 酶活计算的公式 怎么得来的呢 我看了好多参考文献 只是给出一个公式 想知道怎么从酶活的通用公式一步步换算 不知道有没有知道的呢
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5楼2022-03-15 20:57:10
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