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请教2-oxoglutarate-dependent dioxygenases体外酶活检测注意事项 已有2人参与
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| 最近在做一个2-oxoglutarate-dependent dioxygenases的体外酶活活性一直做不出来，于是找了一个文章报道的已知功能的酶去做体外酶活，蛋白纯化没问题，体外酶活条件也是按照文献报道做的，可是也做不出来，求助大神这个反应有没有什么需要注意的细节没。 |
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pennchem
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【答案】应助回帖
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酶的活性及其检测（一）-稳态动力学 近代生命科学的研究的兴起，和酶的研究的发展是同步的。生物，哪怕是最简单的生物都含有众多的高分子物质如核酸，多糖，蛋白，脂类等等。如果没有纯度很高的酶，是无法展开更多研究的。没有酶的作用理论突破，也是无法进行酶的定量研究。第一个发现DNA聚合酶的Arthur Kornberg在核酸复制酶学十诫里面有两条：（1）不要为不纯的酶或（2）不纯的底物而浪费精力[1]。 酶作用的基本要素包括纯的酶，纯的底物，将两者混合后，可以观察底物的消耗，或者看产物的生成，如果检测手段足够，可以看中间态的生成与消耗。下面一个曲线，在学习初期，让我困惑了很久。 这张图中，在前面10（分钟）内，产物的增加呈线性，10-25（分钟）之间产物增加，但是增加速度变慢，在25分钟后，产物不再增加。我在一些文献中，会看到类似的图出现。它反应出的信息是产物增加，随时间变化增加变缓最终达到平台期。解释起来的原因会有多种，（1）随着底物消耗，酶没有足够的底物，最后酶催化反应停滞，（2）酶不稳定，在反应过程中逐渐失活，（3）产物对酶有抑制作用，还有其它可能的解释。 让人困扰的是，有时候图一和米氏曲线（图二）太像了。下面的图中，在一定底物浓度范围内[如10（微摩尔）]，反应速率随着底物浓度增加而线性增加。在10-25（微摩尔）之间，随着底物浓度增加，速率增加趋缓。在25微摩尔之后，反应速率不再随着底物浓度增加而变化将实验数据用方程 y=A×x÷(B+x) （其中A，B为常数，y为反应速率，x是底物浓度） 来拟合，以下为底物的三种特例： （1）当底物浓度很低时 y=lim┬(x→0)〖[A×x÷(B+x)]〗 方程退化为： y =(A/B)×x 此时反应底物浓度低，反应速率与底物浓度呈正比 （2）当底物浓度足够高时 y=lim┬(x→∞)〖[A×x÷(B+x)]〗 方程退化为 y = A (A称为Vmax) 此时反应底物浓度高，反应速率为常数，与底物浓度无关 （3）当y = A/2 方程为 A/2=A×x÷(B+x) 得到 x = B （B称为Km） 利用Igor Plot，拟合米氏方程给出的值是。注：后面给出的不是实验误差值，而是拟合误差。 A =158.25 ± 8.79 （单位） B =10.015 ± 1.73 （单位） A的生化意义是在反应体系中，一定酶浓度能达到的最大反应速率，而B的含义则是酶达到最大反应速率的一半时，对应的底物浓度。 这就是生化课本中的米氏方程。在实验中，底物浓度足够高和足够低是相对B而言，数学意义上的极高和极低在实验中可操作性不强。 在一个酶催化反应体系中，酶的浓度是固定的，酶与底物结合是酶催化底物的前提，如以下平衡： 酶+底物↔酶*底物复合物 而酶催反应的发生最简机理如下： 酶+底物↔酶*底物复合物→酶+产物 ① ② 在反应步骤①及②中，在底物浓度较低情况下，①是限速反应，根据质量作用定律，在一定浓度范围内，酶*底物复合物的形成速率与底物的增加成正比，所以此阶段，反应速率和底物增加呈线性关系。而底物增加到一定浓度后，此时，几乎所有的酶都以酶*底物复合物的形式存在，②变成了限速反应，反应速度和底物浓度没有关系。在反应①时，底物在溶液中移动速率时自由扩散，此步反应为可逆，反应②为不可逆反应（或逆反应速率很小）。 我的老师曾说过做酶动力学实验是生物实验中最容易产生数据的，几组实验下来，总能找到数据来计算A（Vmax）和B（Km）。但我当初做酶活实验时，发现几个问题，（1）底物浓度低时实验数据变动较大，（2）Vmax重复性较好，Km重复性较差。为了得到重复性好的，可靠性高的数据，个人经验如下： （1）选择合理的反应酶浓度，太高，测低底物浓度反应速度数据波动大；太低，反应很容易饱和，Km值偏差特别大 （2）合理筛选反应底物浓度区间及离散距离，建议在Km值两旁平衡分步，在左侧间距相近，右侧间距可以拉开 （3）控制反应温度，有条件的话，让反应温度恒定，搅拌均匀，确信酶在反应监测时间内稳定 （4）如果不同时间内的数据相互比较，用同一批次的酶（可低温分装），用同一批次的底物（最好标定底物浓度），同批配置的反应buffer，同样的反应器皿（如石英杯），同样的检测器等。 先说一下这两张图的联系，在图一中，是底物浓度和时间的关系，所以曲线每个点的切线斜率就是反应速度（浓度/时间）。以每个底物浓度，做一个底物浓度和时间的实验，取其初期的直线部分，计算得到该底物浓度下的反应速率，就得到下图的一个点。对不同底物（如9个）浓度做图一曲线，计算得到9个速率，然后作图二，就完成了米氏实验。根据实验重复原则，一般每个点要重复3次，所以为了得到图二，要做27个图一的实验（称之为re-plot）。 酶和底物需要结合后才能进行催化反应的概念首先被物理化学家Victor Henri在1901年研究糖水解酶时发现，他第一次给出了反应速率与底物和产物浓度的方程式。Henri是酶动力学的先驱，米氏动力学也被称为Henri-Michaelis-Menten kinetics。他的研究启发了德国生物化学家Leonor Michaelis以及加拿大物理学家Maud Menten，他们给出了更简洁的表达式，而且明确的提出了反应机理。 值得注意的是，米氏方程应用于描述的是平均化的结果，其中酶反应过程的中间步骤的信息被平均掉了，如何得到反应过程中的信息，下一篇将会阐述。 原创,图片无法贴上去，转请@pennchem |
7楼2022-03-15 21:03:24
pennchem
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8楼2022-03-15 21:16:59
