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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母KM71真核表达问题 已有6人参与

我用毕赤酵母KM71进行表达抗菌肽,分子量为3kd-8kd之间,构建载体没有问题,载体为pPIC9K,进行筛选也可以筛选到,用载体上的引物与我片段的引物进行验证也没有问题,将其电转进KM71中,进行诱导96h,加甲醇的量为0.5%,诱导条件为250 rpm/30°,酵母生长为2升BMGY,转1/5到BMMY中,诱导96h结束后取上清发酵液进行冷冻浓缩,之后进行考染、Western检测,结果检测不到蛋白,我想请问各位大佬,是否有那个重要的条件我没有注意到,感觉蛋白根本诱导不出来。
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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by panbenxun at 2022-01-15 10:50:12
可以试一下把ppic9k的a-factor删掉,不让它分泌表达,就留在细胞内,然后裂解细胞再检测。...

谢谢,打开了新思路呢
7楼2022-01-15 18:11:00
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。
生物资源交流QQ群:1044518333
2楼2022-01-14 18:30:43
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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by snoopyzxx at 2022-01-14 18:30:43
你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。

嗯嗯,感谢大佬,但是我试过几个,根本没有诱导到蛋白,可能诱导的蛋白有多有少,我也尝试了8个转化子,还是没有诱导到的那种状态。所以我在想是不是有某个条件没有注意到呢
3楼2022-01-14 19:41:16
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panbenxun

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
首先可以在电转之后,筛选转化成功的单克隆时,建议可以进行一轮小量筛选(20*4 ml) ,小量WB鉴定成功后,再大量表达。也需要考虑你的感受态细胞是否正常,另一方面可以缩短诱导时间,蛋白分子量较小,诱导时间过长,可能存在长时间诱导所致的蛋白降解,建议你也可以采取不同诱导时间的小量菌液,来进行WB检验。
4楼2022-01-14 21:05:06
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