应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 毕赤酵母KM71真核表达问题
131/2返回列表12下一页
查看: 3238  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母KM71真核表达问题 已有6人参与

我用毕赤酵母KM71进行表达抗菌肽，分子量为3kd-8kd之间，构建载体没有问题，载体为pPIC9K，进行筛选也可以筛选到，用载体上的引物与我片段的引物进行验证也没有问题，将其电转进KM71中，进行诱导96h，加甲醇的量为0.5%，诱导条件为250 rpm/30°，酵母生长为2升BMGY,转1/5到BMMY中，诱导96h结束后取上清发酵液进行冷冻浓缩，之后进行考染、Western检测，结果检测不到蛋白，我想请问各位大佬，是否有那个重要的条件我没有注意到，感觉蛋白根本诱导不出来。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2022-01-14 10:46:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。
赞一下(2人) 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2022-01-14 18:30:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panbenxun

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先可以在电转之后，筛选转化成功的单克隆时，建议可以进行一轮小量筛选（20*4 ml) ，小量WB鉴定成功后，再大量表达。也需要考虑你的感受态细胞是否正常，另一方面可以缩短诱导时间，蛋白分子量较小，诱导时间过长，可能存在长时间诱导所致的蛋白降解，建议你也可以采取不同诱导时间的小量菌液，来进行WB检验。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2022-01-14 21:05:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panbenxun

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-14 22:43:34
感谢回答，我做过每24 h取一个点，取4 mL,取到了120 h,还是没有检测到，这个有没有可能因为某种原因胞内表达并没有分泌出来，然后我尝试了用细胞破碎仪破碎酵母细胞，在tricine胶上跑出来了一条带，但是大小不对， ...

可以试一下把ppic9k的a-factor删掉，不让它分泌表达，就留在细胞内，然后裂解细胞再检测。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2022-01-15 10:50:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by snoopyzxx at 2022-01-14 18:30:43
你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。

嗯嗯，感谢大佬，但是我试过几个，根本没有诱导到蛋白，可能诱导的蛋白有多有少，我也尝试了8个转化子，还是没有诱导到的那种状态。所以我在想是不是有某个条件没有注意到呢
赞一下 回复此楼
3楼2022-01-14 19:41:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by panbenxun at 2022-01-14 21:05:06
首先可以在电转之后，筛选转化成功的单克隆时，建议可以进行一轮小量筛选（20*4 ml) ，小量WB鉴定成功后，再大量表达。也需要考虑你的感受态细胞是否正常，另一方面可以缩短诱导时间，蛋白分子量较小，诱导时间过长 ...

感谢回答，我做过每24 h取一个点，取4 mL,取到了120 h,还是没有检测到，这个有没有可能因为某种原因胞内表达并没有分泌出来，然后我尝试了用细胞破碎仪破碎酵母细胞，在tricine胶上跑出来了一条带，但是大小不对，tricine胶Maker大小会不会指示的有问题呢：因为我在做一个GST标签时只显示21 kd,但gst是26 kd...
赞一下 回复此楼
5楼2022-01-14 22:43:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by panbenxun at 2022-01-15 10:50:12
可以试一下把ppic9k的a-factor删掉，不让它分泌表达，就留在细胞内，然后裂解细胞再检测。...

谢谢，打开了新思路呢
赞一下 回复此楼
7楼2022-01-15 18:11:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
1
8楼2022-01-17 16:51:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

_草莓圣代_

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-15 18:11:00
谢谢，打开了新思路呢...

请问楼主这样做问题解决了吗
赞一下 回复此楼
9楼2022-06-09 13:26:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

菜鸡咕噜

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-14 10:46:30
我用毕赤酵母KM71进行表达抗菌肽，分子量为3kd-8kd之间，构建载体没有问题，载体为pPIC9K，进行筛选也可以筛选到，用载体上的引物与我片段的引物进行验证也没有问题，将其电转进KM71中，进行诱导96h，加甲醇的量为0 ...

楼主，我最近也在做真核表达，同样也是如此，可以给我一点建议吗，或者我们可以讨论一下

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2022-06-27 08:25:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 qwedfxcv 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 04:18 by gy1nBQXYQJqL
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 04:06 by gy1nBQXYQJqL
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 00:28 by winsaint
[基金申请] 国自然评审意见 +11 wangmingqi 2026-08-28 15/750 2026-08-29 00:17 by fangyl2005
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +3 bud_bud 2026-08-27 6/300 2026-08-28 11:53 by bud_bud
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭