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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 毕赤酵母KM71真核表达问题
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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母KM71真核表达问题 已有6人参与

我用毕赤酵母KM71进行表达抗菌肽，分子量为3kd-8kd之间，构建载体没有问题，载体为pPIC9K，进行筛选也可以筛选到，用载体上的引物与我片段的引物进行验证也没有问题，将其电转进KM71中，进行诱导96h，加甲醇的量为0.5%，诱导条件为250 rpm/30°，酵母生长为2升BMGY,转1/5到BMMY中，诱导96h结束后取上清发酵液进行冷冻浓缩，之后进行考染、Western检测，结果检测不到蛋白，我想请问各位大佬，是否有那个重要的条件我没有注意到，感觉蛋白根本诱导不出来。
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1楼 2022-01-14 10:46:30
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
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你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。
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2楼2022-01-14 18:30:43
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panbenxun

木虫 (小有名气)
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首先可以在电转之后，筛选转化成功的单克隆时，建议可以进行一轮小量筛选（20*4 ml) ，小量WB鉴定成功后，再大量表达。也需要考虑你的感受态细胞是否正常，另一方面可以缩短诱导时间，蛋白分子量较小，诱导时间过长，可能存在长时间诱导所致的蛋白降解，建议你也可以采取不同诱导时间的小量菌液，来进行WB检验。
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4楼2022-01-14 21:05:06
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panbenxun

木虫 (小有名气)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-14 22:43:34
感谢回答，我做过每24 h取一个点，取4 mL,取到了120 h,还是没有检测到，这个有没有可能因为某种原因胞内表达并没有分泌出来，然后我尝试了用细胞破碎仪破碎酵母细胞，在tricine胶上跑出来了一条带，但是大小不对， ...

可以试一下把ppic9k的a-factor删掉，不让它分泌表达，就留在细胞内，然后裂解细胞再检测。
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6楼2022-01-15 10:50:12
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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by snoopyzxx at 2022-01-14 18:30:43
你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。

嗯嗯，感谢大佬，但是我试过几个，根本没有诱导到蛋白，可能诱导的蛋白有多有少，我也尝试了8个转化子，还是没有诱导到的那种状态。所以我在想是不是有某个条件没有注意到呢
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3楼2022-01-14 19:41:16
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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by panbenxun at 2022-01-14 21:05:06
首先可以在电转之后，筛选转化成功的单克隆时，建议可以进行一轮小量筛选（20*4 ml) ，小量WB鉴定成功后，再大量表达。也需要考虑你的感受态细胞是否正常，另一方面可以缩短诱导时间，蛋白分子量较小，诱导时间过长 ...

感谢回答，我做过每24 h取一个点，取4 mL,取到了120 h,还是没有检测到，这个有没有可能因为某种原因胞内表达并没有分泌出来，然后我尝试了用细胞破碎仪破碎酵母细胞，在tricine胶上跑出来了一条带，但是大小不对，tricine胶Maker大小会不会指示的有问题呢：因为我在做一个GST标签时只显示21 kd,但gst是26 kd...
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5楼2022-01-14 22:43:34
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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by panbenxun at 2022-01-15 10:50:12
可以试一下把ppic9k的a-factor删掉，不让它分泌表达，就留在细胞内，然后裂解细胞再检测。...

谢谢，打开了新思路呢
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7楼2022-01-15 18:11:00
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qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
1
8楼2022-01-17 16:51:31
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_草莓圣代_

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-15 18:11:00
谢谢，打开了新思路呢...

请问楼主这样做问题解决了吗
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9楼2022-06-09 13:26:31
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菜鸡咕噜

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-14 10:46:30
我用毕赤酵母KM71进行表达抗菌肽，分子量为3kd-8kd之间，构建载体没有问题，载体为pPIC9K，进行筛选也可以筛选到，用载体上的引物与我片段的引物进行验证也没有问题，将其电转进KM71中，进行诱导96h，加甲醇的量为0 ...

楼主，我最近也在做真核表达，同样也是如此，可以给我一点建议吗，或者我们可以讨论一下

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10楼2022-06-27 08:25:17
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