应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 毕赤酵母KM71真核表达问题
131/2返回列表12下一页
查看: 2790  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母KM71真核表达问题 已有6人参与

我用毕赤酵母KM71进行表达抗菌肽，分子量为3kd-8kd之间，构建载体没有问题，载体为pPIC9K，进行筛选也可以筛选到，用载体上的引物与我片段的引物进行验证也没有问题，将其电转进KM71中，进行诱导96h，加甲醇的量为0.5%，诱导条件为250 rpm/30°，酵母生长为2升BMGY,转1/5到BMMY中，诱导96h结束后取上清发酵液进行冷冻浓缩，之后进行考染、Western检测，结果检测不到蛋白，我想请问各位大佬，是否有那个重要的条件我没有注意到，感觉蛋白根本诱导不出来。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2022-01-14 10:46:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。
赞一下(2人) 回复此楼
VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2022-01-14 18:30:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panbenxun

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先可以在电转之后，筛选转化成功的单克隆时，建议可以进行一轮小量筛选（20*4 ml) ，小量WB鉴定成功后，再大量表达。也需要考虑你的感受态细胞是否正常，另一方面可以缩短诱导时间，蛋白分子量较小，诱导时间过长，可能存在长时间诱导所致的蛋白降解，建议你也可以采取不同诱导时间的小量菌液，来进行WB检验。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2022-01-14 21:05:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panbenxun

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-14 22:43:34
感谢回答，我做过每24 h取一个点，取4 mL,取到了120 h,还是没有检测到，这个有没有可能因为某种原因胞内表达并没有分泌出来，然后我尝试了用细胞破碎仪破碎酵母细胞，在tricine胶上跑出来了一条带，但是大小不对， ...

可以试一下把ppic9k的a-factor删掉，不让它分泌表达，就留在细胞内，然后裂解细胞再检测。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2022-01-15 10:50:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by snoopyzxx at 2022-01-14 18:30:43
你需要多筛几个克隆。毕赤酵母不同克隆的表达量差异很大的。

嗯嗯，感谢大佬，但是我试过几个，根本没有诱导到蛋白，可能诱导的蛋白有多有少，我也尝试了8个转化子，还是没有诱导到的那种状态。所以我在想是不是有某个条件没有注意到呢
赞一下 回复此楼
3楼2022-01-14 19:41:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by panbenxun at 2022-01-14 21:05:06
首先可以在电转之后，筛选转化成功的单克隆时，建议可以进行一轮小量筛选（20*4 ml) ，小量WB鉴定成功后，再大量表达。也需要考虑你的感受态细胞是否正常，另一方面可以缩短诱导时间，蛋白分子量较小，诱导时间过长 ...

感谢回答，我做过每24 h取一个点，取4 mL,取到了120 h,还是没有检测到，这个有没有可能因为某种原因胞内表达并没有分泌出来，然后我尝试了用细胞破碎仪破碎酵母细胞，在tricine胶上跑出来了一条带，但是大小不对，tricine胶Maker大小会不会指示的有问题呢：因为我在做一个GST标签时只显示21 kd,但gst是26 kd...
赞一下 回复此楼
5楼2022-01-14 22:43:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by panbenxun at 2022-01-15 10:50:12
可以试一下把ppic9k的a-factor删掉，不让它分泌表达，就留在细胞内，然后裂解细胞再检测。...

谢谢，打开了新思路呢
赞一下 回复此楼
7楼2022-01-15 18:11:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qwedfxcv

新虫 (初入文坛)
1
8楼2022-01-17 16:51:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

_草莓圣代_

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-15 18:11:00
谢谢，打开了新思路呢...

请问楼主这样做问题解决了吗
赞一下 回复此楼
9楼2022-06-09 13:26:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

菜鸡咕噜

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1楼: Originally posted by qwedfxcv at 2022-01-14 10:46:30
我用毕赤酵母KM71进行表达抗菌肽，分子量为3kd-8kd之间，构建载体没有问题，载体为pPIC9K，进行筛选也可以筛选到，用载体上的引物与我片段的引物进行验证也没有问题，将其电转进KM71中，进行诱导96h，加甲醇的量为0 ...

楼主，我最近也在做真核表达，同样也是如此，可以给我一点建议吗，或者我们可以讨论一下

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2022-06-27 08:25:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 qwedfxcv 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[有机交流] 求有机合成大神指点三硫酸乙烯酯（CAS：2793408-99-6）的合成路线 30+3 Leekmid 2026-05-13 10/500 2026-05-16 16:37 by czyzsu
[有机交流] 如何实现卤原子转化 10+3 BT20230424 2026-05-15 5/250 2026-05-16 16:20 by czyzsu
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 cjf4bx70cj 2026-05-14 6/300 2026-05-16 16:17 by 0i5p09z61n
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 k37jurhrau 2026-05-16 3/150 2026-05-16 13:57 by vcdazktkjx
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 x0mp7owy2b 2026-05-15 3/150 2026-05-16 12:49 by vcdazktkjx
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 xx7gd5zq4e 2026-05-15 5/250 2026-05-16 12:24 by h3oerqvkv9
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 l7k6xnh0yc 2026-05-14 6/300 2026-05-16 11:29 by h3oerqvkv9
[硕博家园] 申请博士 +3 呃?呃 2026-05-15 3/150 2026-05-16 11:01 by a4742549
[考博] 2026博士还有哪些学校有名额 +5 小王求读研 2026-05-15 6/300 2026-05-16 10:44 by a4742549
[基金申请] 这年头没有找到涵评专家，还有中面上的可能吗 +11 dd921ww 2026-05-12 13/650 2026-05-16 09:16 by Howard28
[教师之家] 上海大学实验技术岗位非升即走 +5 嘻嘻哈哈乐呵呵 2026-05-15 5/250 2026-05-16 00:17 by caiyun
[文学芳草园] 窗边初夏的小雨 +8 阿美_Lml888 2026-05-09 11/550 2026-05-15 23:54 by WASM
[考博] 西南大学考核制博士 +4 lijunjie84 2026-05-11 7/350 2026-05-15 23:20 by 同仁堂教主
[文学芳草园] 风把牡丹吹跑了 +5 myrtle 2026-05-12 9/450 2026-05-15 15:27 by myrtle
[基金申请] 精华III:  评审感受-评审感受-评审感受 +14 ferrarichen 2026-05-11 18/900 2026-05-15 11:12 by cmhchen
[基金申请] 重磅！青年科学基金项目（C类）资助增幅预计超过50% +5 水和泥不是水泥 2026-05-13 7/350 2026-05-14 20:57 by 水和泥不是水泥
[有机交流] 求助2，4-二氯-5-嘧啶甲醛的合成方法 20+3 光吃不拉 2026-05-14 5/250 2026-05-14 20:15 by 一切都是空工
[高分子] 本人最近太闲了，谁有问题可以提，每天会统一回复 +8 一切都是空工 2026-05-12 19/950 2026-05-14 20:03 by 一切都是空工
[考博] 材料类只有一篇综述能申博么 +4 乐逍遥谷 2026-05-13 4/200 2026-05-14 12:05 by zhyzzh
[考博] 现在不知道怎么办，感觉很痛苦 +4 qweww 2026-05-11 5/250 2026-05-11 20:23 by Oversize
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭