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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 老生常谈的问题，PCR没有条带。。。
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学员CSJmmu

铜虫 (小有名气)

[交流] 老生常谈的问题，PCR没有条带。。。

这次PCR的目的是扩增一段DNA序列然后插入到质粒里，导入细胞做同源重组的用途。引物是前面带了很长一段限制酶切位点的序列的（应该是用于连接时用吧），模板DNA就是普通的基因组DNA。现在的问题是，用普通的taq酶（premix）能跑出来条带，但是因为扩增的可能不保真，而且末端加了T，所以没办法用来连接。因此选择了高保真酶+dNTP+buffer的组合，但是就是扩增不出来。酶是七八月份买的，买来之后一直就放在-20没有动过。两种酶用的PCR程序是完全一样的，但是体系是按照各自的说明书来配的。现在是初步怀疑酶有问题，但是毕竟是新拆开的。。。又觉得新的应该不会出问题吧。想问问各位前辈，还有那些方面的问题？谢谢～
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1楼 2022-01-07 20:19:26
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木虫 (著名写手)
★
扣扣里(金币+1): 谢谢参与
nature catalysis
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9楼2022-01-14 01:24:56
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Mb67zgi

新虫 (初入文坛)
★
扣扣里(金币+1): 谢谢参与
你的酶是哪一家公司的？不同的酶退火效率是不一样。另外有的商家会在高保真酶里面兑一些其他东西好降低成本。
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5楼2022-01-09 01:22:25
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学员CSJmmu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Mb67zgi at 2022-01-09 01:22:25
你的酶是哪一家公司的？不同的酶退火效率是不一样。另外有的商家会在高保真酶里面兑一些其他东西好降低成本。

高保真酶是NEB的。最新的情况是我跑完PCR测了一下浓度，发现NEB的虽然没有条带但是双链DNA浓度是1500多ng/ul，另外一个能跑出来条带的反而低
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6楼2022-01-10 20:14:20
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shuaibia6

金虫 (小有名气)
★
扣扣里(金币+1): 谢谢参与
这是一个很常见的问题，小木虫上面以前也有很多这样的帖子，taq酶能扩增而pfu等高保真酶扩不出是很正常的，问题不是你的酶有没有失效（当然也不排除这个可能），而是尝试重新摸索高保真的反应条件。
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10楼2022-01-14 09:03:02
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nono20094楼
2022-01-08 00:18   回复  
扣扣里(金币+1): 谢谢参与
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tzynew2楼
2022-01-07 20:24   回复  
扣扣里(金币+1): 谢谢参与
o 发自小木虫Android客户端
dingxiaojun7楼
2022-01-10 20:28   回复  
扣扣里(金币+1): 谢谢参与
发自小木虫Android客户端
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