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greatsaint

银虫 (小有名气)

[交流] 大家帮我看看我的双酶切电泳图是怎么回事

刚做了个阳性克隆质粒的双酶切,但是总是没有结果,不知道什么原因。M是1kb plus DNA marker,1、2、5(从左边数)没有条带估计是样品的问题。3和4是双酶切后的图,6和7是未酶切的质粒,其中6和3是同一个样品,7和4是同一个样品。不知道为什么同一样品跑出来的条带不在同一水平线上,即使是酶切不成功也不应该是这样的呀。质粒大小约4kb,目的片段约750bp。Marker上样量太小,不清楚,但还可以区分条带。
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houjinglhy

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amisking(金币+4,VIP+0):欢迎发帖交流! 8-25 18:16
6和7基本还是一个条带吧
可能是胶没跑好或没放正才会出现这种稍微有点偏的情况
质粒肯定是切开了 至于有没有切成两条带不好说
因为你的条带太暗了 它们的亮度是4000:750 有可能看不清的
加大上样量再酶切试试 我做酶切现在都是一个一个切 双切老出问题
从小就学习鲁迅,直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助,却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊!
2楼2009-08-25 18:10:15
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)

切了多长时间?
3楼2009-08-25 21:00:44
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anik

银虫 (正式写手)

你的条带是切开了的。环形的质粒在电泳时比线性的DNA跑的速度快,所以跑在下面。
至于3、4两泳道是切开后的大片断,小片断没有看到会不会是跑出去胶了?你可以提高胶的浓度。
另外胶时,如果是先加入EB的话,那就再多加点,如果后加的,那就染色时间再长点。
4楼2009-08-25 22:30:41
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greatsaint

银虫 (小有名气)

谢谢了!我再试试
5楼2009-08-26 08:09:59
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greatsaint

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by wordsworth3180 at 2009/8/25 21:00:
切了多长时间?

切了有5h吧。
6楼2009-08-26 08:10:22
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kxjh

金虫 (小有名气)


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如果是筛选阳性克隆的话,有可能是假阳性;如果是重组质粒,想获得目的片段或只是验证,可以提高抽质粒浓度或加样量,也可以延长酶切时间试试。
7楼2009-08-26 09:12:31
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spiderboy

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流! 8-26 20:10
有三种可能:
1、切开的那两个条带已经很弱了,很有可能750的非常弱,看不到了。加大量试下。
2、只有一个酶切正常进行了,另一个没有切开。调整体系重做下,或者,一次一次切。
3、有的酶切位点在第一次酶切后会发生甲基化,导致连接后的阳性克隆不能再用原来的两个酶切位点来鉴定了,你要查下你的两个位点会不会是这种情况。
8楼2009-08-26 20:09:12
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sdvet

铜虫 (小有名气)

解释


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(1)应该认为质粒切开了。5小时酶切其实可以短点  ,长时间酶切量又少易降解
(2)34    67 可以认为都在一条线上
(3)750bp看不见,建议 a  加大酶切上样量   b  换小M 跑时间短点


建议,不中听勿怪:      清晰的实验图像 是结果分析的有力证据     楼主这样的图像能用来做什么呢? 仅仅是听听大家的意见吗?        我们可以给楼主提供实验的可能结果,但是没有清晰的图像一切都只是猜测,科学不允许有猜测。

     呵呵 ”良药苦口利于病,忠言逆耳利于行“  得罪了

[ Last edited by sdvet on 2009-8-26 at 22:29 ]
9楼2009-08-26 22:26:52
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