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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教：接头连接是否会在表达产物中引入所需克隆外的氨基酸？
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honglix

银虫 (正式写手)

[交流] 请教：接头连接是否会在表达产物中引入所需克隆外的氨基酸？

在克隆DNA两端引入接头时，是否会在其表达产物中加入额外的氨基酸？引入的接头如果碱基数是除以3后余2个或1个碱基时，是否会引起翻译时的移码而表达出所不需要的产物？若是，怎样消除；如不是，是什么原因？
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1楼 2009-08-25 12:55:37
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panacea007

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by anik at 2009-8-25 22:21:
楼上的几个观点我不尽相同。
在蛋白表达时，无论原核还是真核，核糖体结合到mRNA上，只有找到ATG这个起始密码子才开始翻译。
前面的接头无论多少，对其表达是没有多大影响的。
原核和真核表达载体上的启动子只 ...

如果做真核分泌表达，一般的表达载体顺序是 ： promotor  -  signal peptide  - Multi cloning  site   (target gene insertion)

启动子很多都用载体本身的，在目的基因之前，而且为表达出信号肽，肯定是用自带的ATG，不会用目的基因的ATG。  怎么会不影响表达？？

这里所说的是  表达出来可能会额外带几个氨基酸 （酶切位点编码）

[ Last edited by panacea007 on 2009-8-26 at 10:27 ]
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11楼2009-08-26 10:26:06
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
honglix(金币+1,VIP+0): 8-25 20:46
所谓接头，只是在克隆时起连接作用的，它是位于启动子和终止子之外的，所以是不会翻译的。只有位于启动子和终止子之间的部分在表达时才被翻译。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
2楼2009-08-25 13:30:44
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
honglix(金币+1,VIP+0): 8-25 20:46
从起始密码子向前3个3个推就行，引入酶切位点如果不注意就会移码。
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Thank-you，so-blue.
3楼2009-08-25 14:55:50
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panacea007

银虫 (小有名气)
★
honglix(金币+1,VIP+0): 8-25 20:47
看看你用什么表达体系，以及怎么表达了。

如果用E. coli做胞内表达，就不存在这个问题，因为你会加一个起始密码子，酶切位点应该在起始密码子外，不会翻译。

如果用Pichia pastoris 做胞外表达， 加入不合适的酶切位点肯定会引起表达，因为你的基因肯定是连在信号肽后面，而表达是从信号肽开始的。

选择多克隆位点的酶切位点 一般不会移码突变，自己看看就是了。

[ Last edited by panacea007 on 2009-8-25 at 15:06 ]
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4楼2009-08-25 15:05:32
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