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[交流]
黄嘌呤氧化酶抑制实验-体外降高尿酸实验
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我做了一个体外降高尿酸实验,用了2种实验方法: 1.XOD 抑制活性测试 反应体系体积为 200 μL,依次向 96 孔板中加入样品 40 μL, 20 U/L 的 XOD 溶液 80 μL,在恒温培养箱内 40℃ 孵育 30 min,之后加入 500 μmol/L 底物黄嘌 呤溶液 80 μL,放入 40℃ 恒温培养箱中孵育 15 min,然后在 292 nm 处记录吸光 度值。实验分别设置有样品组(含样品、酶及底物)、空白组(含底物和样品, 不含酶)、阳性对照组(含别嘌呤醇、酶及底物)、酶组(含酶和底物,不加样品), 各个组均含 3 个复孔,实验重复三次,各样品终浓度为 100 μg/ m L,XOD 抑制 率计算公式为:抑制率(%)=[1-(样品 OD 值-空白 OD 值)/(酶 OD 值-空白 OD 值)]×100%。 这个方法获得实验数据抑制率(%)大于100%。样品与阳性药物的抑制率在高浓度下大于100% 2 NBT法 空白组XOD活性的测定:吸取50mmol·L-1磷酸缓冲液3mL加入至10mL容量瓶中,加入3mL黄嘌呤溶液(2.0mmol·L-1)和0.4mL氯化硝基四氮唑蓝(NBT,1.8mg·L-1),摇匀,即得XOD活性测定空白溶液。向该空白溶液中加入2.5mL黄嘌呤氧化酶溶液(0.08U·mL-1),摇匀,得到XOD活性测定溶液,以酶加入时间开始计时,于25℃反应30min后采用752型紫外光栅分光光度计测其560nm下的吸光度值(A0)。样品对XOD抑制活性测定:精密吸取阳性对照药别嘌呤醇(allopurinol)、样品溶液0.5mL,分别置于10mL容量瓶中,按空白组的操作分别加入缓冲液、黄嘌呤溶液和NBT,以酶加入时间开始计时,相同反应条件下,测得各样品的吸光度值(Ax),根据公式:抑制率(%)=(A0-Ax)/A0×100%计算各化合物对XOD的抑制率。 这种方法存在的问题:不同浓度样品与阳性对照的抑制率不存在梯度,而且抑制率很接近。且阳性药物(别嘌呤醇)在12.5μM的浓度下抑制率只有20%。2种都是相同样品进行测试,得到的抑制率也都不一样。 想请教群里朋友们在做体外XOD 抑制活性测试的时候是否有遇到我一样的情况? |
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